运动通过干预线粒体自噬调控心肌炎症反应的机制研究

发布时间：2018-04-12 21:41

本文选题：衰老心肌 + 有氧耐力运动　；参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2016年博士论文

【摘要】：第一部分有氧耐力运动通过调控线粒体自噬干预衰老心肌炎症反应的机制研究研究目的延缓人体心肌的衰老进程,对改善老年人生活质量具有非常重要的现实意义。炎性衰老是指在自然衰老进程中机体内促炎症反应状态慢性进行性升高的现象,是衰老研究领域的热点。适量的运动训练是目前公认的抗心肌衰老的有效方式,但具体机制尚未完全阐明。本研究以有氧耐力运动干预小鼠衰老心肌为模型,以氧化应激、炎症反应及线粒体自噬调控为研究内容,拟证实:(1)衰老心肌线粒体来源的ROS激活NLRP3炎症小体,NLRP3炎症小体切割炎症因子IL-1β前体为有活性的IL-1β引发炎症反应,炎症反应又可损伤心肌细胞增加线粒体释放ROS,从而产生恶性循环并最终导致心肌衰老的发生发展。(2)有氧耐力运动可通过上调线粒体自噬,减少线粒体来源ROS的释放,下调NLRP3炎症小体介导的心肌炎症反应,从而达到抗心肌衰老的效果,并为寻找防治心肌衰老的有效靶点提供理论依据。研究内容与方法将80只雄性C57BL/6小鼠随机分为青年对照组(Young control group:YC,n=20)、青年训练组(Young training group:YT,n=20)、衰老对照组(Aging control group:AC,n=20)和衰老训练组(Aging training group:AT,n=20)。其中YT和AT组动物置于小动物跑台中进行中等负荷耐力运动训练,即0°,17m/min,每天1次,每次30min,每周5次,共12周。采用超声成像系统检测小鼠心功能;处死动物,称重计算心系数;通过HE染色方法,观察各组小鼠心肌的组织形态学变化;采用透射电镜技术,观察各实验组小鼠心肌组织超微结构的改变;采用Oxygraph-2k呼吸测量仪,测量心肌线粒体态3(ST3)与态4(ST4),且计算呼吸控制比(RCR);采用JC-1荧光标记法,检测线粒体的膜电位;通过荧光素与荧光素酶的生物发光法,测定ATP合成活力;荧光标记DCFH-DA测量线粒体ROS生成速率;采用紫外分光光度法检测线粒体Mn SOD的活性、MDA含量和蛋白羰基含量;荧光定量PCR法检测小鼠心肌自噬相关蛋白(Beclin1、LC3、Bnip3)和炎症因子(NLRP3、IL-1β)m RNA水平表达;Western-Blot技术检测小鼠心肌自噬相关蛋白(Beclin1、LC3、Bnip3)和炎症因子(NLRP3、IL-1β)蛋白水平表达;ELISA法测定小鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。研究结果与青年对照组相比,衰老对照组小鼠左心功能下降,而相比衰老对照组,衰老运动组小鼠左心功能升高;与青年对照组相比,青年运动组、衰老对照组小鼠的心系数数值显著升高,相比衰老对照组,衰老运动组小鼠的心系数数值显著升高;与青年对照组相比,衰老对照组小鼠心肌纤维呈现疏松分布、线粒体可见较多空泡,相比衰老对照组,衰老运动组小鼠心肌肌纤维排列较整齐,可见明显的自噬泡。与青年对照组相比,衰老对照组小鼠线粒体呼吸功能显著下降,相比衰老对照组,衰老运动组线粒体呼吸功能显著升高;与青年对照组相比,衰老对照组小鼠氧化应激损伤增强,而相比衰老对照组,衰老运动组小鼠氧化应激损伤明显减弱;与青年对照组相比,衰老对照组小鼠的心肌炎症反应增强,而相比衰老对照组,衰老运动组小鼠的心肌炎症反应明显减弱;与青年对照组相比,衰老对照组小鼠的线粒体自噬水平下降,而相比衰老对照组,衰老运动组小鼠的线粒体自噬水平明显上升。研究结论(1)氧化应激、NLRP3炎症小体介导的炎症反应参与了心肌衰老的发生发展。(2)长期的有氧耐力运动训练能够有效地改善衰老心脏的心功能。(3)长期的有氧耐力运动训练通过上调线粒体自噬起到抗心肌衰老的作用。(4)长期的有氧耐力运动训练最终通过上调线粒体自噬水平,减轻心肌的炎症反应,从而达到抗心肌衰老的效果。第二部分急性运动中线粒体应激诱导的心肌炎症反应及线粒体自噬的反馈调控研究目的大量的研究表明,不同强度、形式的运动可以对机体产生不同的生物学效应,尤其是对心肌功能影响的差异。一些科研人员发现,适度的耐力训练可提高机体的免疫功能,促进机体的防病、抗病能力。但另一方面,大强度的急性运动对机体则产生许多不良反应,如急性大强度的运动,特别是长时间、高强度的运动,会引起机体骨骼肌、结缔组织的损伤,并诱发炎症反应。多年的研究表明,过量的大强度运动会促进机体炎症水平的升高,对机体产生不利影响。经过不断的深入研究,许多科学家发现在急性大强度运动的运动期间及运动后的各阶段,在机体血浆中,一些炎性因子的水平会明显升高,并触发随后的炎症反应。但目前,关于急性大强度运动造成心肌炎症反应的原因及其可能的调控机制,还尚不清楚。因此,本研究检测了大鼠在急性运动期及其随后的恢复期中心肌的线粒体功能、心肌NLRP3小体的激活程度和线粒体自噬相关蛋白的表达水平,从而探讨在急性运动及恢复过程中,线粒体应激反应诱导心肌炎症反应的分子调控机制。研究内容与方法将64只SD雄性大鼠,随机分为8个实验组:即安静对照组(RC,n=8)、运动45min组(E-45,n=8)、运动90min组(E-90,n=8)、运动120min组(E-120,n=8)、运动后恢复12h组(R-12,n=8)、运动后恢复24h组(R-24,n=8)、运动后恢复36h组(R-36,n=8)、运动后恢复48h组(R-48,n=8)。急运模型的建立:将各运动组和运动后恢复组的大鼠,置于动物跑台中,实施一次急性的负荷递增的跑步运动。通过HE染色方法,观察各组大鼠心肌的组织形态学变化;采用JC-1荧光标记法,检测大鼠心肌线粒体的膜电位;通过呼吸测量仪(Oxygraph-2k),检测心肌线粒体的态3与态4的呼吸速率,计算线粒体的呼吸控制比(RCR);通过荧光素与荧光素酶的生物发光法,检测心肌线粒体ATP的合成活力;利用DCFH-DA荧光标记法,监测心肌线粒体ROS的生成速率;采用紫外分光光度法检测心肌线粒体Mn SOD的活性、MDA含量和蛋白羰基含量;采用Western blot法,检测各组大鼠心肌组织中NLRP3,IL-1β、Beclin1、LC3、Bnip3的蛋白含量;ELISA法测定大鼠血清中IL-1β的含量。研究结果实验结果表明,在急性运动中大鼠心肌的线粒体功能进行了适应性调节以满足心肌应激反应,运动性线粒体的应激反应也增强了活性氧的生成和诱发了NLRP3炎症小体激活的炎症反应。此外,线粒体自噬相关蛋白质包括Beclin1、LC3、Bnip3在急性运动早期和恢复早期都显著升高,这表明急性运动诱导的线粒体自噬可以通过清除功能失调的线粒体,以减轻心肌氧化应激和炎症反应。研究结论急性运动期间,线粒体应激激活NLRP3炎症小体引发大鼠心肌炎症反应,并诱导了线粒体自噬的反馈性调节,以减少急运中大鼠心肌的炎性损伤。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.21

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