Visfatin对内皮祖细胞凋亡的影响及其机制探讨

发布时间：2018-04-13 17:00

本文选题：Visfatin + 内皮祖细胞　；参考：《河北医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是Asahara在1997年首次描述的一种来源于骨髓存在于外周血并且能够定向分化为内皮细胞的前体细胞。EPCs具有增殖和修复能力,在机体血管组织损伤后,EPCs通过动员、迁移、归巢以及形成毛细血管网一系列过程,促进血管损伤部位内皮再生和修复。EPCs尚能分泌生长因子激活血管局部的成熟内皮细胞,进一步参与血管修复过程。目前随着人们生活方式的改变,糖尿病的发病率逐年上升,心血管并发症是糖尿病患者的主要死因。研究表明糖尿病患者EPCs数量减少、功能损伤与心血管并发症的发生和发展密切相关,EPCs数量减少和功能下降被认为是心血管疾病的标志。EPCs受多种因素的影响,肥胖、高血压、高血糖、脂代谢紊乱等患者均存在EPCs数量减少及功能受损。Visfatin由脂肪细胞分泌。研究发现,visfatin在2型糖尿病患者和代谢综合征患者体内,尤其是有动脉粥样硬化病变的患者体内表达增强。在代谢相关疾病中visfatin水平变化导致炎症反应和血管内皮功能受损,其可能是动脉粥样硬化过程中影响炎症反应的关键环节。糖尿病患者存在EPCs功能受损,而visfatin是影响血管内皮功能的重要因素,我们前期研究发现visfatin能够损伤大鼠EPCs迁移、粘附功能,但具体机制不详。本研究从EPCs凋亡这一角度探讨visfatin损伤EPCs的具体机制。目的:观察visfatin对EPCs凋亡的诱导作用,并探讨visfatin诱导凋亡的具体机制。方法:采用密度梯度离心法分离健康分娩妇女脐带血中的单个核细胞,接种到纤维连接蛋白(fiber protein,FN)包被的培养皿中,经EMG-2MV(20%胎牛血清,1%青霉素链霉素双抗,0.04%氢化可的松,0.1%肝素,0.1%维生素C,50ng/ml胰岛素样生长因子1,10ng/ml表皮生长因子,50ng/ml成纤维细胞生长因子,50ng/ml血管内皮生长因子,10μg/ml纤维连接蛋白)重悬,在37℃、5%CO2、湿度95%恒温培养箱培养。每天在倒置显微镜下观察细胞形态。培养第7天,采用流式细胞仪检测EPCs表面特异性抗原CD34与CD309表达,采用激光共聚焦显微镜鉴定EPCs特性。细胞经同步化处理后,第8天随机将EPCs分为visfatin不同浓度(0,50,100,150ng/ml)干预组与抑制剂组。Visfatin不同浓度干预组孵育EPCs48小时。抑制剂组分别加上visfatin抑制剂FK866(10μM)与核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)抑制剂BAY11-7085(5μM)孵育EPCs1小时后,分别加入150ng/ml visfatin孵育EPCs 48小时。收集细胞,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,Real-Time PCR检测EPCs中天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase 3)、Bax、Bcl-2、NF-κB的m RNA表达水平,Western Blot检测EPCs中caspase 3、Bax、Bcl-2、NF-κB、白细胞介素-6(inter-leukin-6,IL-6)、细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule1,ICAM1)蛋白表达水平。结果:1 EPCs的分离培养与鉴定分离单个核细胞在培养48小时后大部分细胞贴壁,呈鹅卵石样。以后细胞逐渐伸展,形态改变,呈纺锤状。10天以后部分细胞聚集成集落样生长。流式细胞术检测CD34与CD309双阳细胞为EPCs。激光共聚焦显微镜下可见EPCs可以摄取1,1'-二(十八烷基)-3,3',3',3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸(Di I)乙酰化低密度脂蛋白(Acetylated Low Density Lipoprotein,Ac-LDL)(Di I-Ac-LDL),呈红色,结合FITC标记荆豆凝集素-1(Ulex europaeus agglutinin-1,UEA-1)(FITC-Lectin-UEA-1),呈绿色,双染细胞呈橘黄色。2 Visfatin对EPCs凋亡的影响:与0 ng/ml组相比,visfatin(50ng/ml,100ng/ml,150ng/ml)呈剂量依赖诱导EPCs凋亡,150ng/ml visfatin组有统计学差异(P0.05);caspase 3、Bax m RNA与蛋白表达升高,150ng/ml visfatin组有统计学差异(P0.05),Bcl-2 m RNA与蛋白表达下降,各组间差异无统计学意义(P0.05);150ng/ml visfatin组Bax/Bcl-2 m RNA与蛋白比值均升高,差异有统计学意义(P0.05)。与150ng/ml visfatin组相比,抑制剂FK866干预组凋亡率下降,有统计学差异(P0.05);caspase 3、Bax m RNA与蛋白表达、Bax/Bcl-2 m RNA与蛋白比值下降,差异有统计学意义(P0.05),Bcl-2 m RNA与蛋白表达升高,无统计学差异(P0.05)。3 Visfatin对EPCs中炎症相关因子表达的影响与0ng/ml组相比,visfatin(50ng/ml,100ng/ml,150ng/ml)组EPCs的IL-6与ICAM1蛋白表达升高,150ng/ml visfatin组差异有统计学意义(P0.05)。与150ng/ml visfatin组相比,抑制剂FK866干预组ICAM1蛋白表达下降,有统计学差异(P0.05),IL-6蛋白表达降低,无统计学差异(P0.05)。4 NF-κB在visfatin诱导EPCs凋亡中的作用与0ng/ml组相比,visfatin(50ng/ml,100ng/ml,150ng/ml)组EPCs中NF-κB的m RNA与蛋白表达升高,150ng/ml visfatin组有统计学差异。与150ng/ml visfatin组相比,BAY11-7085干预组EPCs凋亡受到抑制,caspase 3、Bax的m RNA与蛋白表达下降,Bcl-2的m RMA与蛋白表达升高,ICAM1与IL-6蛋白表达下降,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1用密度梯度离心法分离的人脐静脉单个核细胞经EMG-2MV培养后,可以分化为CD309、CD34表达阳性的EPCs。2 Visfatin呈剂量依赖诱导EPCs凋亡,上调凋亡相关蛋白的m RNA与蛋白表达。3 Visfatin通过激活NF-κB通路,诱导EPCs高表达ICAM1与IL-6炎症因子,进而诱导EPCs产生凋亡,抑制NF-κB通路可以抑制visfatin诱导的EPCs的凋亡反应及炎症因子的表达。
[Abstract]:Vascular endothelial progenitor cells ( EPCs ) were first described by Asahara in 1997 . The expression of caspase - 3 , Bax , Bcl - 2 , Bax , Bcl - 2 and NF - 魏B in EPCs was detected by flow cytometry . Compared with the 150ng / ml visfatin group , the expression of Bcl - 2 mRNA and protein in EPCs decreased significantly ( P0.05 ) . Compared with the 150ng / ml visfatin group , the expression of Bax / Bcl - 2 mRNA and protein were significantly different ( P0.05 ) . Compared with the 150ng / ml visfatin group , the expression of Bax / Bcl - 2 mRNA and protein were significantly different ( P0.05 ) . Compared with the 150ng / ml visfatin group , the apoptosis of EPCs induced by BAY11 - 7085 was inhibited , and the expression of ICAM - 1 and IL - 6 decreased and the expression of ICAM - 1 and IL - 6 decreased .

【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543

【引证文献】