出生后早期小鼠心脏长链非编码RNA表达谱特征分析
发布时间：2018-04-15 05:17
本文选题：lncRNA + 心肌细胞增殖 ； 参考：《第三军医大学》2017年博士论文
【摘要】：心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)发病率占全球慢性非传染性疾病的50%,死亡率位居全球最高。尽管有传统针对心血管疾病的防治措施,但发病率仍然呈现逐年上升之势。近年来,越来越多的证据表明心血管早期发育异常与疾病发生密切相关,因此,研究心血管发育有利于解析心血管疾病新的发病机制。哺乳动物在出生后心肌细胞会经历一个关键性的过渡期,在这个过渡期内心脏会经历细胞生长方式、线粒体动态以及能量利用等过程的转变,其中,在出生后早期心肌细胞即出现由增殖性生长向肥厚性生长的转变,该转变使得出生后7天内的心肌损伤可以完全修复。该转变过程可能受多种生长因子、信号通路等的调控,然而,其精确的调控机制目前并不清楚。长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200核苷酸的非编码RNA,其作用机制多、调控范围广,具有重要的生物学功能,如调控细胞生长、分化、凋亡、自噬等。近年研究发现lncRNA参与调控心脏发育和心脏疾病的发生发展,然而,其与出生后早期心脏增殖-肥厚转变的关系目前并不清楚。本研究旨在探索lncRNA与该增殖-肥厚转变的关系。方法和结果:1.出生后早期小鼠心脏lncRNA表达谱特征分析1.1出生后早期小鼠心脏lncRNA表达谱概况随机取3窝出生后(P) 1天、7天、28天C57BL/6J小鼠心脏组织,RNA提取纯化后做lncRNA芯片分析。芯片共检测到来自University of California Santa Cruz,Refseq,Ensembl等多个数据的18,158个lncRNA的信号,其中,大多数lncRNA长度在200到3000个核苷酸之间。根据与邻近基因的位置关系可将lncRNA划分为多种形式,其中,绝大多数为基因间LncRNA(intergeniclncRNA),其数目在10000个以上。根据差异倍数、FDR(false discovery rate)值定义差异表达lncRNA为差异倍数2、FDR0.05,其中,P1、P7之间差异LncRNA个数为765, P7、P28之间差异lncRNA个数为4855。对三个时间点芯片分析得到的数据做ANOVA处理后,共得到P1,P7及P28之间差异表达lncRNA 1146个,其中,依次上调的253个,依次下调的487个,先上调后下调的315个,先下调后上调的91个。1.2出生后早期小鼠心脏差异表达lncRNA的生物信息学分析针对P1,P7, P28三个时间点得到的1146个差异表达lncRNA和1358个差异表达mRNA进行趋势(the series test of cluster,STC)分析,各得到16种表达模块,每个模块对应一种变化趋势及其对应的变化趋势相似的lncRNA和mRNA。其中,lncRNA和mRNA各得到7个变化趋势最显著的表达模块,这7个模块在lncRNA和mRNA里变化趋势一致。此外,lncRNA和mRNA变化趋势最显著的模块也相同,P1到P7变化较平缓、P7到P28迅速下调。这些变化趋势高度一致的差异lncRNA和mRNA提示它们之间可能存在相互作用关系。为进一步探讨lncRNA和mRNA的相互作用关系及其在心脏早期发育中的功能,我们进一步对差异表达lncRNA和mRNA构建了共表达网络,位于该网络核心区的基因大多均参与心脏早期发育和细胞周期调控。从芯片结果得到1146个差异表达lncRNA共有879个邻近基因,其中差异表达的邻近基因有59个。在这59对lncRNA-邻近基因中,35对lncRNA和邻近基因随时间变化趋势正相关,11对负相关,这种正相关或负相关的关系提示lncRNA对邻近基因可能的调控作用。其中,部分邻近基因参与心脏早期发育,如Ccbe1,Vcan等。此外,我们还利用KEGG数据库对这些差异表达的邻近基因作了 gene ontology (GO)和Pathway分析,结果发现这些邻近基因普遍参与细胞周期的调控过程如DNA复制、转录等,部分邻近基因参与调控细胞增殖-肥厚转变的通路如AMP-activated protein kinase(AMPK)。这些结果说明差异表达lncRNA可能通过调控这些邻近基因的表达进而参与早期心脏发育。我们从转录因子的水平上探讨差异表达lncRNA的上游调控机制,从共lncRNA-mRNA共表达网络里选取度最高的100个lncRNA和mRNA,分析其启动子区域转录起始位点(上游1000bp至下游200bp)和转录因子(transcription factor, TF),构建TF-lncRNA-mRNA网络,得到多个调控核心lncRNA和mRNA的TF。此外,根据TF,lncRNA,mRNA构建的前馈环可以发现,每个TF可调控多个差异表达lncRNA和mRNA,而每个差异表达lncRNA或mRNA可受多个TF调控。这些结果提示这三元之间的复杂关系构成了调控心脏早期发育的分子网络。2.出生后早期心脏lncRNA的验证、筛选及作用探索2.1 lncRNA芯片结果验证及组织特异性检测选取芯片中P1到P28依次上调和依次下调差异表达倍数最高的各5个lncRNA,利用定量PCR技术进行验证,其结果与芯片一致。在芯片结果中找出这10个lncRNA的差异表达邻近基因,共得到3个,利用定量PCR技术进行验证,结果与芯片也一致。为了筛选心肌特异性lncRNA,我们利用定量PCR技术在心、肾、血管、骨骼肌、肝、小肠6个组织中分别检测这10个lncRNA的表达,最后得到一个心肌特异性较高的lncRNA,ENSMUST00000117266。2.2 ENSMUST00000117266共表达网络分析选取皮尔森系数0.97以上的lncRNA和mRNA,构建ENSMUST00000117266的共表达网络,共得到81个分子,其中44个是编码基因。这些基因大多涉及心脏发育,如Hmga2参与胚胎期心脏发生和出生后的心脏发育,Ccbe1与心脏祖细胞特化有关,Cited1对于胚胎心脏发育和存活十分关键等。这些结果提示ENSMUST00000117266可能参与心脏早期发育的分子调控网络。2.3ENSMUST00000117266对缺氧、百草枯、心梗等心脏不利刺激敏感提取新生小鼠心脏做原代心肌细胞培养,在缺氧条件刺激6小时后,ENSMUST00000117266mRNA水平显著下调。新生小鼠出生后皮下连续三天注射自由氧(reactive oxygen series,ROS )诱导剂百草枯(paraquat ),心脏组织ENSMUST00000117266mRNA水平明显下降。20周小鼠(不分性别)构建心梗模型,发现心梗后2天心脏ENSMUST00000117266 mRNA水平明显增多而3天后显著下降。这些结果提示ENSMUST00000117266对于早期心脏应对外界不利刺激十分敏感。2.4 ENSMUST00000117266参与调控心肌细胞增殖活性为了进一步验证ENSMUST00000117266对出生后早期心脏增殖-肥厚转变的影响,我们利用siRNA技术转染新生小鼠原代心肌细胞48小时后,利用流式细胞术检测心肌细胞周期活性。结果发现ENSMUST00000117266敲低后,G1/G1期的心肌细胞明显减少,G1/M期的心肌细胞显著增多,S期的细胞无明显改变。收取siRNA敲低后的心肌细胞,利用定量PCR检测增殖相关基因Ccnd1、Myh10和肥厚相关基因Myh6、Myh7,结果发现,ENSMUST00000117266敲低后心肌细胞Ccnd1 mRNA水平明显下降。此外,利用rhBmp10处理心肌细胞6天增殖活性后再进行siRNA转染,发现ENSMUST00000117266 敲低也可以显著抑制 rhBmp10 上调 Ccnd1、Myh10 以及 TGFβ通路的Nkx2.5、Mef2c的mRNA水平。这些结果提示ENSMUST00000117266参与调控心肌细胞的增殖活性。2.5 ENSMUST00000117266可以调控邻近基因Sap301的表达提取新生小鼠心脏RNA,利用PCR技术进行胞核胞浆检测,发现ENSMUST00000117266在胞核和胞浆分布大致均等。之后,分别利用siRNA和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)技术转染新生小鼠原代心肌细胞,转染48小时后检测邻近基因Hand1、Larp1、Sap301 mRNA水平改变,结果发现siRNA和ASO技术均可敲低ENSMUST00000117266水平,且敲低后Sap301的mRNA水平显著下降,提示ENSMUST00000117266可以通过转录或转录后机制调控邻近基因Sap301的表达。结论(1)通过lncRNA芯片分析,我们发现了出生后早期(P1, P7和P28)小鼠心脏的lncRNA差异表达谱;STC分析提示差异表达lncRNA与差异基因之间存在相互调控关系;GO、Pathway分析进一步提示差异lncRNA可通过调控邻近基因影响心脏增殖-肥厚转变;利用转录因子预测我们还发现了差异表达lncRNA可能的上游调控TF。(2)我们首次发现了一个新的心肌组织特异性lncRNA ENSMUST00000117266,共表达分析提示该lncRNA参与调控心脏发育相关基因,且其对缺氧、百草枯、心梗等不利刺激十分敏感;利用siRNA或ASO手段敲低心肌细胞ENSMUST00000117266活性后,我们发现其参与调控心肌细胞增殖活性,其机制与邻近基因Sap301有关。
[Abstract]:蹇冭绠＄柧鐥，
本文编号：1752681
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/xxg/1752681.html
最近更新
教材专著
