去甲基化药物治疗较高危骨髓增生异常综合征的疗效预测及耐药相关机制的研究

发布时间：2018-04-16 03:25

本文选题：骨髓增生异常综合征 + 阿扎胞苷　；参考：《南方医科大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景：骨髓增生异常综合症(myelodysplastic syndrome. MDS)是一组起源于造血干细胞的异质性、恶性克隆性疾病,基本病变是克隆性造血干、祖细胞发育异常(dysplasia),导致无效造血或病态造血,高风险向急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia, AML)转化,临床表现为难治性一系或多系细胞减少的血液病,疾病的结局主要是死于血细胞减少导致的感染和出血等合并症以及向AML演变。任何年龄均可发病,但常见于老年人,约80%的患者年龄均大于60岁。国外流行病学显示年发病率约3/10万～3.5/10万,随年龄增长有上升趋势,中位年龄60-75岁,男女比例为1.2：1,男性略多于女性,女性每年的发病率为2.7/10万,而男性为4.5/10万。目前MDS的诊断仍没有所谓的“金标准”,主要是采用多因素、综合性和动态的指标,根据患者的病史、体检、血常规、血清铁蛋白水平、维生素B12水平、EPO水平、FA水平、骨髓涂片、活检、染色体、流式、FISH,基因突变以及排他性疾病检测,参照维也纳标准,进行评估分析从而诊断。治疗骨髓增生异常综合症主要解决两大问题：AML转化、骨髓衰竭及并发症。骨髓增生异常综合症是一种异质性疾病,自然病程和预后差异很大,应根据患者的国际预后评分(IPSS-R),同时结合患者体能状况(ECOG)、年龄、依从性等各方面进行综合评定,从而选择治疗方案。一般而言,较低危MDS以低强度治疗为主,以改善造血,提高生活质量乃至延长生存期；中高危组MDS以高强度治疗为主,包括化疗和异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT),以获得缓解、提高存活、改变自然病程和改善生活质量为主要目标。关于中高危骨髓增生异常综合症的治疗疗效仍是世界型难题,异基因造血干细胞移植依然是唯一能根治MDS的方法,但MDS多为老年患者,大部分已丧失移植机会,而对于稍年轻患者,供体干细胞来源的限制、费用、移植相关并发症等因素也大大限制了其广泛应用。去甲基化药物(Hypomethylating agents, HMAs)出现之前,除了支持治疗和造血生长因子,并没有特殊药物能改变其难治性疾病的面貌,而中高危MDS患者的治疗方案普遍都是化疗,但反应率很低,且不良事件多,亦无法遏制其向白血病转化。去甲基化药物,包括地西他滨(Decitibine,DAC)和阿扎胞苷(Azacitidine, AZA),治疗MDS的总反应率(overall response,OR)为40-60%,且可能改变MDS的自然病程。自2006年去甲基化药物地西他滨首次被FDA批准使用后,现已成为国内外中高危骨髓增生异常综合征的一线治疗方法,大量多中心Ⅱ、Ⅲ期临床试验数据表明,地西他滨较传统的化疗、对症支持治疗,显示出很大的优势性。然而,地西他滨虽对MDS疗效显著,但临床使用中仍存在很多问题。第一费用高,在中国地西他滨属于自费用药,按标准剂量20mg/m2/d,共计5天用量,一个疗程约5万；第二、起效慢,国内外研究表明地西他滨需使用4-6疗程后方能评价其是否有效,这同时也意味着对于中国患者,你需花费20-30万的费用方可知其是否有效；第三、无停药指征,临床使用过程中发现中途停药患者,会疾病复发或疗效丧失,且体外研究发现在中断用药后,MHL1基因启动子的再次甲基化；第四、耐药发生率高,临床结果显示,地西他滨的总反应率为50%,即约一半的患者对此药无效(称之为原发性耐药),而另一部分患者在用药有效过程中,疾病复发或丧失原有疗效(称之为继发性耐药)。且一旦发生去甲基化药物耐药,患者预后都很差。目前,该药物的具体耐药机制不明,但有研究指出药物的代谢途径在疾病的耐药机制中起着重要的作用。在体内,地西他滨如同其他胞嘧啶核苷类似物一样,通过平衡型核苷转运蛋白hENT1与hENT2进入细胞,一部分并在细胞内由脱氧胞苷激酶(Deoxycytidine kinase, DCK)进行磷酸化,将其转化成单磷酸化衍生物5-AZA-dCMP。随后,5-AZA-dCMP进一步磷酸化成其活性模式5-AZA-dCTP纳入DNA,从而诱导脱甲基化作用。此外,另一部分进入胞内的地西他滨经过胞苷脱氨酶(Cytidine deaminase, CDA)转化为代谢物质5-AZA-UdR排出体外。早在1993年,Stegmann AP等便发现在地西他滨的耐药细胞株模型中,DCK的活性表达在其耐药机制中起着关键作用。随后,他们在小鼠的白血病细胞株中,180天内逐步将地西他滨浓度从0.1mmol/L增加至10mmol/L,从而建立耐药细胞株,并在此过程中监测DCK的活性表达,结果提示在所有成功建立了的继发性地西他滨耐药的细胞株中,DCK基因出现基因缺失及多种基因突变,而当对该耐药细胞株转入DCK基因时,又恢复对地西他滨的敏感性。再者,他们又在急性髓系白血病的小鼠动物模型中进一步验证出DCK的基因突变亦可以诱导出地西他滨的耐药。近年来,Qin.T等在体外实验研究发现,5种原发性耐药细胞株Jurkat, MOLT4, PC3, RKO与DU145中,均出现DCK、hENT1与hENT2的低表达以及CDA的高表达。其中,在Jurkat细胞株与DU145细胞株中,由mRNA水平决定的DCK蛋白表达水平很低,而地西他滨的半数抑制浓度(IC50)恰恰与DCK的mRNA表达水平相关(R=0.63,P=0.038),这表明DCK基因的mRNA水平及蛋白表达水平与地西他滨的耐药相关。此外,在白血病细胞株HL60中,地西他滨过度暴露亦会诱导其自身耐药,且与DCK基因由杂合子突变成纯合子相关。目前,研究发现在对阿糖胞苷产生耐药的套细胞淋巴瘤细胞株中,最重要的分子学特征是DCK基因的mRNA水平及蛋白表达水平,同时亦会对另一种核苷酸类似物吉西他滨产生交叉耐药。在乳腺癌的细胞株中亦证实该核苷酸类似物吉西他滨的耐药机制与DCK基因表达下调相关,使用siRNA方法对该DCK基因进行基因敲除后会产生吉西他滨耐药,而相反,对该基因进行表达上调时,恢复吉西他滨药物敏感性。总之,MDS是一组高度异质性的恶性疾病,去甲基化治疗虽是其治疗史上的里程碑,但尚存在很多不足,我们试图通过从甲基化药物的临床资料、相关代谢基因水平及凋亡基因水平、基因突变等方面,寻找可能为MDS患者提供可预测去甲基化疗效以及患者生存期的指标、探索其耐药的相关机制。本论文分三部分：第一部分：去甲基化药物治疗MDS患者的临床疗效预测指标目的：回顾性分析我院接受去甲基化药物治疗的骨髓增生异常综合征患者,探讨其疗效及生存期与临床特征的关系。方法：回顾性分析我院自2009年11月至2013年11月接收去甲基化药物治疗2个疗程以上的60例初诊骨髓增生异常综合征患者(共计接受537个疗程,中位疗程数为7疗程,2-23疗程)。收集患者所有的临床资料,包括患者用药方案、年龄、性别、初诊时诊断分型、IPSS评分、细胞遗传学及患者用药前血小板数值、治疗第一疗程后血小板数值、治疗第二疗程后血小板数值,同时为进一步探索患者血小板增倍与总生存时间的关系,我们对所有患者进行2年以上的生存期随访,每1-3月电话随访一次,直至患者死亡或失访。采用SPSS 20.0统计分析软件包进行数据的统计分析,接受去甲基化治疗进行疗效判定的有效组与无效组间的患者分布特征使用卡方检验(Pearson Chi-square test)或费舍尔精确检验(Fisher's exact test),而两组间的生存时间采用Kaplan-Meier法进行检验。结果：1、60例初诊MDS患者接受去甲基化药物治疗,共计接受573个疗程,中位疗程数为7个疗程(2-23疗程)。该60例患者中,平均中位年龄为59岁(33-79岁),其中18例患者接受阿扎胞苷,42例患者接受地西他滨。基于WHO诊断标准的RAEB-Ⅰ患者16例,RAEB-Ⅱ患者33例,骨髓原始细胞30%的急性髓系白血病患者1例。根据IPSS (International Prognosis Scoring System)评分标准,38例患者细胞遗传学好,12例患者细胞遗传学差,余10例患者中等。根据MDS国际工作组疗效评判标准,33例患者治疗有效,27例患者治疗无效,总反应率为55%。统计学分析发现,阿扎胞苷与地西他滨间的疗效相当(P=0.234)。年龄(P=0.069),性别(P=0.759),IPSS评分(P=0.115)及细胞遗传学(P=0.839)均与去甲基化药物的疗效无关,但初诊时诊断为较低危MDS患者(RCMD)的疗效则显著低于较高危患者(P=0.033)。2、在这60例患者中,18例患者接受去甲基化治疗2个疗程后达到血小板增倍,其中15患者治疗有效,即在接受去甲基化药物2个疗程后达到血小板增倍的患者总反应率为83.33%。且在该18例患者中,用药前血小板中位数值为39x 109/L[标准差(standard deviation, SD) 55×109/L,范围：10-174×109/L],接受治疗1个疗程后增长到74×109/L(SD:118×109/L, range:18-391 ×109/L),2个疗程后增长至164×109/L(标准差：168×109/L,范围：25-730×109/L)(图1)。而其他42例未达到血小板增倍的患者中,2个疗程后18例患者治疗有效,总反应率为42.86%。进行统计学分析发现,接受去甲基化药物治疗2疗程后,发生血小板增倍的患者有效率明显高于未发生者(83.33% VS 42.86%,P=0.004),即2个疗程后血小板达到增倍是去甲基化治疗有效的一项临床预测指标。3、在接受地西他滨治疗的患者中,血小板增倍的患者生存期更长(中位生存期,38月VS 14月,P=0.021), 而单独接受阿扎胞苷的患者中,血小板增倍的患者生存期并未发生变化。但综合年龄、性别、IPSS评分、是否移植进行多因素生存分析发现,无论是地西他滨抑或是阿扎胞苷,血小板增倍都是独立的与生存期相关的预后因素(中位生存期,24月VS 16月,P=0.025),此外,IPSS评分亦与生存期相关(P=0.035)。结论：1、接受去甲基化药物治疗2疗程后血小板达到增倍的患者对去甲基化药物反应好2、接受去甲基化药物治疗2疗程后血小板达到增倍的患者生存时间更长第二部分：地西他滨相关代谢基因表达水平在其产生原发性耐药及继发性耐药的机制研究目的：探索接受地西他滨治疗的MDS患者代谢基因表达水平与其产生原发性耐药及继发性耐药的关系。方法：我们选用37例接受地西他滨治疗的骨髓增生异常综合征患者(34例)及急性髓系白血病患者(3例),其中31例患者(包括28例MDS患者及3例AML患者)至少接受了2个疗程以上的达珂规范治疗。在此28例MDS患者中,根据国际MDS工作组IWG疗效标准,14例患者接受地西他滨治疗有效,14例患者治疗无效,即14例患者产生原发性耐药。其中,在治疗有效的患者中,5例患者达到不少于8个疗程的持续骨髓完全缓解(continued mCR),5例患者在治疗过程中丧失疗效或复发,即5例患者产生继发性耐药。在此研究中,我们共收集该31例患者的44份骨髓或外周血样本,27对样本。其中28份样本取于该28例MDS患者接受地西他滨治疗前,5份样本取于5例患者复发时,5份样本取于5例持续骨髓完全缓解患者第八疗程时,6份标本来自3例AML患者初诊时与复发时。我们使用QT-PCR方法监测此28例患者达珂治疗前的相关代谢基因(包括hENT1, dCK与CDA)及凋亡基因(BCL2L10)的mRNA水平,从而比较反应组与未反应组的基因水平。此外,我们继续监测5例持续CR患者的第4次mCR后、第8次mCR后及8例复发患者(包括另3例复发的AML患者)复发时的mRNA水平,比较二者基因水平有无差别。结果：1、在达珂治疗无效的患者中,hENT1基因的表达水平明显低于治疗有效的患者(P=0.004),而其他基因,包括CDA、DCK及BCL2L10基因表达水平无明显差别(CDA,P=0.201; DCK,P=0.687; BCL2L10, P=0.201),这表明hENT1基因表达水平是MDS患者接受地西他滨治疗后产生原发性耐药的潜在预后因子。2、地西他滨的代谢相关基因(DCK基因,CDA基因,hENT1基因)及凋亡相关基因(BCL2L10基因)表达水平在男性、女性分布表达水平均无差别,分别为96.70±36.3 vs 128.72±36.3 (P=0.157),2048.69±1254.57 vs 1679.65±1555.03 (P=0.295),191.91±66.68 vs 217.75±94.38 (P=0.295) 及 1.19± 1.21 VS 1.45±0.75(P=0.176),这意味着性别与代谢基因表达分布水平无关。3、在疾病丧失疗效时或复发时,DCK基因表达水平较初诊时明显降低(P=0.012),而其他基因表达水平,包括CDA基因、hENT1基因及BCL2L10基因表达水平,与初诊时相比较并无明显差异,P值分别为CDA (P=0.484), hENT1 (P=0.208) 及 BCL2L10(P=0.093),而持续mCR的患者DCK基因表达水平较初诊时并无明显差别(P=0.222)。结论：1、hENT1基因表达水平是MDS患者接受地西他滨治疗后产生原发性耐药的潜在预后因子。2、DCK基因表达水平是MDS患者及AML患者接受地西他滨治疗后产生继发性耐药的潜在预后因子。第三部分：TET2、ASXL1基因突变及TP53基因突变与地西他滨产生耐药的机制研究目的：探索接受地西他滨治疗的MDS患者TET2基因突变及ASXL1基因突变与其疗效间的关系。方法：我们选用53例接受去甲基化治疗2疗程以上的患者,收集该53例患者治疗前的53份骨髓或外周血样本,进行二代测序并分析基因突变结果,比较TET2基因突变、ASXL1基因突变及TP53基因突变与去甲基化药物疗效的关系及与患者生存期之间的关系。结果：1、53例患者中、接收去甲基化治疗有效的患者为29例,总反应率为53.7%,其中共有14例患者发生TET2基因突变,突变发生率为26.41%,ASXL1基因突变存在于9例患者中,突变发生率为16.98%,TP53基因突变存在于7例患者中,突变发生率为。所有突变一例为纯合突变,其他均为杂合突变,包括点突变,错义突变,无义突变,移码突变,插入突变等。其中,3例患者同时含有TET2基因、ASXL1基因两种突变,其中1例患者同时含有三种基因突变。2、在这发生TET2基因突变的14例患者中,7例患者治疗有效,7例患者治疗无效,无明显统计学意义(P=0.620)。而在发生ASXL1基因突变的9例患者中,2例患者治疗有效,7例患者治疗无效,进行统计学分析发现,ASXL1可能是地西他滨治疗疗效差的一个潜在预后因子(P=0.075),不过仍需扩大样本量来进一步证实。TP53基因突变亦与疗效无关(P=0.174),但生存分析发现其与患者生存期短密切相关(P=0.007),而TET2基因突变(P=0.513)及ASXL1基因突变(P=0.110)则与生存期无关。结论：1、ASXL1基因突变可能是MDS患者接受去甲基化治疗疗效较差的因素2、TP53基因突变可能是MDS患者生存期短的预后因素
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R551.3

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