建立评估肺动脉高压病理重构的新方法及BMPR2突变数据库

发布时间：2018-04-16 11:15

本文选题：小鼠 + 肺高血压模型　；参考：《北京协和医学院》2017年硕士论文

【摘要】：目的右心导管法检测小鼠右心室血液动力学指标,操作时间长,成本高且成功率低。本研究旨在建立一种呼吸机辅助的开胸直视操作检测小鼠右心室血液动力学指标的方法,并用以评估小鼠病理生理条件下的血液动力学状态。方法雄性8周龄C57BL/6小鼠16只,采用完全随机设计法将小鼠分为对照组和低氧组,每组8只。低氧组小鼠在模拟海拔5500 m环境的低压低氧舱(氧浓度10%)内持续饲养,对照组小鼠饲养于常压常氧环境中。3周后对两组小鼠进行血液动力学检测,气管插管,开胸,采用0.7 mmx 19mm密闭式留置针,从心尖处进针5 mm测量右心室压力。结果开胸法检测小鼠右心室血液动力学指标,从气管插管到获得右心室血流参数耗时5-10 min,成功率100%。对照组和低氧组小鼠在麻醉状态下心率差异无统计学意义[(306.4 ±11.5)次/min 比(320.4 ±16.0)次/min,p0.05]。低氧组小鼠右心室收缩压高于对照组[(22.6±1.0)mmHg比(17.1±1.0)mmHg,p0.01],右心室平均压高于对照组[(12.4±0.3)mmHg 比(9.6±0.8)mmHg,p0.01)],右心室内压最大上升速度和下降速度的绝对值均显著大于对照组[(639.7 ± 47.7)mmHg/s 比(421.3 ± 30.6)mmHg/s 比和(-496.5 ± 40.6)mmHg/s 比(-324.3 ± 24.0)mmHg/s,p均0.01]。结论开胸方法检测小鼠右心室血液动力学指标,操作简便、成功率高,可以很好地反应小鼠在不同病理生理条件下的血液动力学状态。背景:右心衰是肺动脉高压患者死亡的主要原因。在临床中及早发现肺动脉高压患者右心室变化对于疾病的预后具有重要作用,但是传统超声指标不能在早期反应右心室重构和损伤。超声二维斑点追踪技术是一种新的无创的评估心室功能的手段,它在左心室评价中得到广泛应用,但是在右心室中研究较少。方法:一次性腹腔注射野百合碱(55mg/kg)构建肺动脉高压大鼠模型。在注射药物后的第0天,第7天,第14天,第28天,第42天等多个时间点上,使用右心导管检查术、传统超声、超声二维斑点追踪技术、心脏重量、病理染色评估大鼠的肺动脉结构和压力及右心室结构和功能。结果:我们采用不同的研究方法经过6周的连续观察。右心导管结果显示肺动脉压力(mPAP)和传统超声测量的肺动脉直径(PVdiam)在肺动脉高压模型建模后的第二周显著升高;但是传统超声检测的右心室的结构和功能在造模后第二周没有变化,包括右心室及血管的结构指标:右心室游离壁厚度(RVAW,d)、室间隔厚度(IVSd)、肺动脉直径(PVdiam);功能指标:射血分数(EF)、三尖瓣环位移(TAPSE)、血流加速时间比射血时间(PAAT/PAET)、肺动脉最大射血速度(PVpeakvel)。超声二维斑点追踪技术检测的大鼠右心室壁的向心应变力(RS,day0 v.s.day1435.54 ±4.21%v.s.22.14±3.61%,p0.05)和向心应变率(RSR,day0 v.s.day14 6.58±0.671/Sv.s.4.19±0.51 1/S,p0.01)在第二周检测出大鼠的右心室运动的变化。使用大鼠第二周的应变力(p= 0.08)和应变率(p = 0.04)的中位数值,将这两个指标分为高分组和低分组,使用Kaplan-Meier统计学方法绘制死亡曲线。两组均显示高分组的预后比低分组的好,存活率高;第二周的应变率能够预测大鼠的预后。目的遗传性肺动脉高压和特发性肺动脉高压是高致死性的罕见疾病,病理机制还不清楚。BMPR2是目前已知的最主要的肺动脉高压的致病基因,但是直到目前尚未有理想的动物模型。我们通过回顾文献,确定BMPR2高频突变位点,为构建遗传修饰动物模型奠定基础。方法首先通过PubMed数据库中的文献进行查找,阅读筛选;然后采用Excel整合数据库,得到独立突变的数据库;再次,将数据库中频率大于3突变筛选出来,采用SIFT,Polyphen2,MutationTaster数据库,评估突变位点的保守性,进一步确认该基因突变为致病性突变;最后,综合文献信息数据库信息筛选出合适构架动物模型的突变。结果我们共得434个独立的基因突变,通过Vector NTI软件和UCSC数据库确定基因的绝对位置;统计发现的其中仅一次的突变占78%;突变分布在所有的编码区,但是主要分布在激酶结构域。二次建库总结出突变频率大于等于3的突变,共26个,主要的突变类型为错义突变和无义突变。对频率大于等于3次的突变,采用SIFT数据库进行蛋白质保守性筛选,得20个突变。突变频率大于等于10的位点有4个,其中c.2695CT(p.R899X,n=11)已经成功的制造了肺动脉高压小鼠模型;c.C1471T(p.R491 W,n.= 11)在数据库中突变频次为11次。我们课题组于2004年通过遗传性肺动脉高压的研究报道过此基因突变;在SIFT数据库的评分为0分(0.05 代表有害),在 Polyphen2 和 Mutation Taster 中评分均为 1(0.95 有害)。并且该基因突变与其他突变比较,在患者中分布范围较广。结论我们经过阅读文献搜索和SIFT等数据库等多重筛选,确定使用c.C1471 T(p.R491W)构建BMPR2基因突变肺动脉高压大鼠模型。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R544.1

【参考文献】