细胞色素上皮源性因子对巨噬细胞清道夫受体CD36表达的影响

发布时间：2018-05-24 06:10

  本文选题：细胞色素上皮源性因子 + CD36　； 参考：《山东大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景动脉粥样硬化(artherosclerosis,AS)是临床患者发生心血管疾病的重要病理学基础,患有AS的患者有较大可能发生心肌梗死、主动脉狭窄、脑出血、外周动脉疾病等,严重威胁着人们的身体健康。AS的发病机制主要包括血管内皮损伤、血脂沉积、炎症等,血管内皮损伤会增加内皮对脂蛋白及其他血浆成分的通透性;内皮调节功能紊乱失调,内皮素的释放增加,一氧化氮(NO)的合成与分泌量减少;内皮粘附分子如细胞粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、E-选择素、P-选择素表达量增加;从而降低了内皮的抗栓功能。AS的发生也是一种慢性炎症性疾病,临床的发生以血管平滑肌细胞增生与血脂沉积后形成粥样斑块为发病特点,发病时常可见动脉管腔壁上存在小米粥样的脂类物质沉积,会导致动脉管腔的狭窄与动脉血管壁的弹性降低。有临床研究表明,AS是造成冠心病发生的最重要的病因,我国每年因冠心病致死的患者人数居世界第二位,而我国因AS致死患者总量在所有致死性疾病中位于首位,根据流行病学及对国内患者死因统计的结果,在未来十年,我国因冠心病造成的死亡率仍将会呈不断上升的趋势。因此如何早期发现AS的病变并有效抑制AS的发生发展,是临床的热点话题。AS的形成是以巨噬细胞不断吞噬脂蛋白形成泡沫细胞为起始阶段。在整个AS的进程中都始终伴随着巨噬细胞的吞噬和巨噬细胞的炎症反应。巨噬细胞吞噬脂蛋白是由受体介导的,CD36是其中最为关键的受体之一。CD36是一种B类清道夫受体,在人体的单核-巨噬细胞、微血管内皮细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、血小板等多种细胞表面高度表达。CD36的基因定位在7号常染色体的q11.2,在人体内可以促进特异性脂质分子如氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、长链脂肪酸(Long Chain Fatty Acid,LFA)等多种分子的摄取,另外也可以与生物大分子相结合,通过传导细胞信号,引发相关的炎症、噬菌以及凋亡等细胞过程的发生。色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)是丝氨酸蛋白酶抑制因子的一类,但并不具备抑制蛋白酶的功能,位于染色体短臂17p13.1区,其基因共有八个外显子及七个内含子组成,三维空间结构的电荷分布具有明显的不对称性。PEDF是一种多功能蛋白,具有营养、保护神经、抗肿瘤、抗血管生成、抗血管通透性作用,还可以抑制炎症反应与血栓的形成。PEDF可以抑制血小板表面的粘附因子-P选择蛋白的表达,因此可以抑制血小板的激活及凝集,阻断NADPH氧化酶与胶原蛋白诱导的ROS生成,达到抗血栓形成、保护血管的目的。近期研究发现PEDF具有抑制巨噬细胞的炎症反应,对AS的稳定性有保护作用,发挥抗AS的作用。CD36是介导巨噬细胞吞噬脂质的关键受体,CD36受体的表达增加可以促进巨噬细胞吞噬作用,进而促进AS进展,我们推测,PEDF可能通过抑制CD36的表达,抑制巨噬细胞吞噬作用,进而发挥抗AS作用。研究目的1.体内实验揭示PEDF过表达对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块内CD36的表达的影响。2.体外实验揭示PEDF对巨噬细胞清道夫受体CD36的表达的影响。研究方法本研究使用SPF级8周龄apoE-/-雄性小鼠20只作为实验研究对象,将实验动物饲养于山东大学齐鲁医院动物实验中心进行1周的适应性饲养,根据随机数字表法将全部小鼠分为对照组与PEDF组,每组小鼠各10只。使用高脂喂养方法(高脂饲料配方:小鼠基础饲料94.3%,猪油3%,胆固醇2%,胆酸钠0.5%,丙基硫氧嘧啶0.2%,将高脂饲料按照配方的比例搭配好后,将饲料进行烘干后仔细保存,用于实验小鼠的喂养。)喂养16周后,给予PEDF组小鼠尾静脉注射含有PEDF的慢病毒,注射剂量为1×108TU/只,对照组小鼠给予同等量的尾静脉阴性病毒注射,4周后将两组小鼠处死后,将小鼠主动脉根部组织进行取材后迅速置于4%多聚甲醛溶液中,使用常规石蜡包埋与切片处理。将RAW264.7细胞种植于6孔板,使用高糖DMEM(10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素)将细胞贴壁培养24h后分成四组,分别为ox-LDL组、ox-LDL+阴性病毒转染(G)组、ox-LDL+PEDF组、Con组。待细胞贴壁8h后,将腺病毒包围的PEDF以MIC值为30转染进ox-LDL+PEDF组细胞,在转染后24h观察细胞转染的情况。分别给予 ox-LDL 组、ox-LDL+G 组、ox-LDL+PEDF 组的细胞群 ox-LDL80 μ g/ml,不给予Con组。。CD36蛋白表达的检测使用免疫组化染色法,并按照SP-9001免疫组化试剂盒的说明书的步骤进行操作。免疫组化的一抗为兔抗鼠CD36多克隆抗体,按照1:100的比例进行稀释;阴性对照一抗为PBS。使用新鲜配置好的DAB溶液进行显色,显色时间3-5min后使用自来水进行充分的冲洗,再次使用苏木素进行复染、脱水、透明、中性树胶封片。将每例小鼠的标本放置于显微镜400倍的视野下进行选择,选取每张切片中主动脉组织分布及染色均匀的4个视野,应用Image pro-Plus 6.0图文分析系统对结果进行定量分析。将呈现棕色反应颗粒的细胞判定为阳性,CD36蛋白的阳性表达水平以视野下阳性表达面积与总面积的比值进行计算。RAW264.7细胞的CD36蛋白表达使用免疫印迹法进行检测。将各组RAW264.7细胞进行收集后将各组细胞中总蛋白进行提取,使用Bradford法测定蛋白浓度,放置于-40℃的环境下保存。将蛋白提取液使用10%的SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白、转膜、封闭,一抗CD36以1:1000的比例在恒温4℃下孵育过夜,二抗孵育2h,ECL发光孵育5min后将蛋白置于Image pro-Plus 6.0图像分析系统下进行图像扫描,目的蛋白的灰度值与内参蛋白的灰度值比值作为相对蛋白表达水平。收集各组RAW264.7细胞,按照试剂盒的说明书将各组细胞的RNA提取后进行反转录,将反转录产物加入PCR反应体系中,使用离心机瞬时离心后放置于PCR仪进行扩增。扩增的条件为30-35循环,95℃下预变性180s,变性30s,56℃下退火30s,72℃延伸50s,72℃延伸10min。将阳性标准品与PCR产物各10uL与2.5%的琼脂糖凝胶电泳20min,对结果观察并记录分析。使用SPSS 20.0软件对实验数据进行统计分析,计量资料以(x±s)的表达方式进行描述,组间比较使用T检验。统计学比较以P0.05表示有意义。研究结果1.小鼠斑块内巨噬细胞表面CD36蛋白表达对两组小鼠主动脉根部组织处AS斑块处巨噬细胞表面的CD36蛋白表达情况进行测定,免疫组化结果见图1。PEDF组小鼠的CD36表达为(29.00±0.58)%,对照组小鼠的CD36表达为(14.00±1.16)%,两组小鼠的CD36表达情况比较,差异具有统计学意义(P0.05),与对照组比较,PEDF组小鼠主动脉根部处巨噬细胞表面的CD36蛋白表达明显较低。2.RAW264.7细胞CD36蛋白表达使用免疫印迹法对四组RAW264.7细胞中CD36的蛋白表达情况进行检测,结果见图 2。其中 ox-LDL 组为(0.75±0.06),ox-LDL+G 组为(0.83±0.07),ox-LDL+PEDF 组为(0.55±0.00),Con 组为(0.34±0.03)。将 Con 组作为对照组,ox-LDL组与ox-LDL+G组细胞中的CD36蛋白表达水平均显著高于对照组,有显著性差异(P0.05),ox-LDL+PEDF组细胞的CD36蛋白表达水平则明显低于ox-LDL组与ox-LDL+G组,有显著性差异(P0.05)。3.RAW264.7细胞CD36 mRNA水平表达使用RT-PCR对四组RAW264.7细胞的CD36 mRNA表达情况进行检测,结果见图 3,其中 ox-LDL 组为(6.93±0.14),ox-LDL+G 组为(8.34±0.16),ox-LDL+PEDF组为(1.81±0.23),Con组为(1.01±0.03)。Con组为对照组别,与其相比,ox-LDL 组与 ox-LDL+G 组的 CD36 表达情况显著增加(P0.05),ox-LDL+PEDF组与ox-LDL组及ox-LDL+G组比较,CD36表达情况显著降低(P0.05)。研究结论1.PEDF具有抑制巨噬细胞表面CD36表达的作用。2.ApoE-/-小鼠转染PEDF病毒载体后,AS斑块内CD36的表达明显降低。
[Abstract]:The pathogenesis of AS is one of the most important causes of coronary heart disease . The pathogenesis of AS is the most important cause of coronary heart disease . The effects of PEDF on the expression of CD36 in apoE - / - mouse atherosclerotic plaques were studied . After 16 weeks of feeding , the PEDF group mice were given the slow virus containing PEDF , the amount of injection was 1 脳 108 TU / , and the control group mice were injected with the same amount of tail vein negative virus . After 4 weeks , the cells were cultured in 4 % polyformaldehyde solution . The cells were cultured for 24 h . The cells were transfected into ox - LDL + PEDF group . The ox - LDL + PEDF group was transfected into the ox - LDL + PEDF group . The expression of CD36 protein was detected by immunohistochemical staining . The expression level of CD36 protein in each group was analyzed by the method of Western blotting . The expression of CD36 protein in each group was determined as positive . The expression level of CD36 protein was determined as positive . The expression level of CD36 protein was analyzed by using Western blotting . The results showed that the expression of CD36 protein in each group was incubated at 4 鈩，

本文编号：1927976