TMEM16A对高肺血流性肺动脉高压调控机制的研究

发布时间：2018-05-26 18:29

本文选题：TMEM16A + 肺动脉高压　；参考：《广西医科大学》2015年博士论文

【摘要】：目的：验证TMEM16A在大鼠肺动脉平滑肌细胞上的表达及分布规律,探索可能由TMEM16A介导的CaCC的电生理学特点。方法：将SD大鼠随机分为正常组、假手术组和分流组。通过腹主动脉-下腔静脉造瘘分流法建立高肺血流性肺动脉高压大鼠模型,术后11周测定肺动脉压力。HE染色及免疫组化检测TMEM16的分布；qRT-PCR检测TMEM16A mRNA在各组肺动脉平滑肌细胞的表达水平：Western blot检测TMEM16A蛋白的表达；全细胞膜片钳记录CaCC电生理学特点。结果：分流组大鼠肺动脉压力较正常组和假手术组显著上升(P0.01),提示分流手术成功建立高肺血流性肺动脉高压动物模型。HE染色病理检查可见分流组大鼠肺小动脉管壁增厚、管腔狭窄。免疫组织化学染色显示TMEM16A主要分布于肺动脉平滑肌细胞膜。qRT-PCR结果显示,分流组TMEM16A mRNA表达水平较正常组和假手术组显著增高(P0.01),而正常组和假手术组之间无统计学差异(P0.05)。Western blot结果显示,分流组TMEM16A蛋白表达水平较正常组和假手术组均显著增高(P0.01),而正常组和假手术组之间差异无统计学意义(P0.05)。通过全细胞膜片钳实验在肺动脉平滑肌细胞记录到稳定的CaCC电生理特征,其表现出外向整流性和Ca2+敏感性。分流组肺动脉平滑肌细胞的电流密度较正常组和假手术组显著增高,I-V曲线上移(P0.01),而正常组和假手术组之间电流密度无统计学差异(P0.05)。结论：(1)TMEM16A在高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞上存在高表达,可能参与了肺动脉高压的发生过程。(2)高肺血流性肺动脉高压发生过程中,肺动脉平滑肌细胞膜上电流及电流密度增高,可能是肺动脉高压的发生机制之一密度较正常组和假手术组显著增高,I-V曲线上移(P0.01),而正常组和假手术组之间电流密度无统计学差异(P0.05)。目的：为了进一步探索高肺血流性肺动脉高压中TMEM16A是否调控肺动脉平滑肌细胞上的CaCC及其电生理变化,我们通过构建慢病毒载体、RNAi技术下调TMEM16A基因的表达,从而为进一步阐明TMEM16A在高肺血流性肺动脉高压中的作用奠定基础。方法：根据第一部分建立的高肺血流性肺动脉高压动物模型,动物分组、肺动脉压力测定、原代肺动脉平滑肌细胞培养均同第一部分。利用RNAi技术,制备慢病毒载体后进行慢病毒包装,对特异性目的基因TMEM16A进行细胞转染。通过qRT-PCR和Western blot分别检测慢病毒对TMEM16A基因mRNA和蛋白的干扰效率。筛选出最高效率的干扰载体,通过qRT-PCR和Western blot分别检测肺动脉平滑肌细胞转染前后TMEM16A基因mRNA和蛋白表达量的变化。全细胞膜片钳实验检测细胞转染前后电生理变化。结果：经过慢病毒载体的制备、慢病毒包装和细胞转染等步骤,顺利将带有绿色荧光的慢病毒转染至肺动脉平滑肌细胞中。qRT-PCR和Western blot方法筛选出具有最高效率的干扰载体(83%)。对转染前后各组肺动脉平滑肌细胞的TMEM16A mRNA表达量进行比较,正常组、假手术组和分流组的表达量较各自转染之前显著下降(P0.01)。转染前后各组肺动脉平滑肌细胞的TMEM16A蛋白表达量进行比较,正常组、假手术组和分流组的表达量均较各自转染之前显著下降(P0.05)。正常组、假手术组和分流组肺动脉平滑肌细胞在转染前后电流显著下降,电流密度均较各自转染之前显著下降(P0.01)。转染后分流组CaCC电流密度较转染后正常组(P0.01)和假手术组(P0.05)均显著增加,而转染后正常组与转染后假手术组CaCC电流密度之间无统计学差异(P0.05)。结论：(1) 成功构建表达TMEM16A基因siRNA的慢病毒载体并筛选出具有较高干扰效率的RNA干扰载体。(2)经RT-PCR和Western blot证实,通过细胞转染方式有效降低TMEM16A mRNA和蛋白表达,降低细胞膜电流及电流密度。(3)TMEM16A通过调控CaCC的方式参与高肺血流性肺动脉高压的发生。转染前后电生理变化。目的：第二部分通过细胞转染的方式下调TMEM16A基因的表达,为进一步研究该基因在高肺血流性肺动脉高压的发生过程中的作用提供了重要的反向功能研究手段。因此我们继续利用这一技术方法,探索TMEM16A对肺动脉平滑肌细胞增殖功能的影响及其可能作用的信号通路。方法：根据第一部分建立的高肺血流性肺动脉高压动物模型,动物分组、肺动脉压力测定、原代肺动脉平滑肌细胞培养均同前述部分,以肺动脉平滑肌细胞为实验对象,利用第二部分建立的RNA干扰载体进行后续实验。通过MTT实验检测各组肺动脉平滑肌细胞增殖变化,应用Westernblot检测PCNA、P-ERK、ERK蛋白的表达。结果：细胞接种后48小时后,肺动脉平滑肌细胞逐步进入对数生长期,分流组增殖活性较正常组和假手术组明显增高(P0.01),而正常组与假手术组之间无差异(P0.05)。各组肺动脉平滑肌细胞进行针对TMEM16A基因的转染,敲低TMEM16A基因的各组细胞增殖速度均显著下降(P0.01)。转染前分流组肺动脉平滑肌细胞PCNA表达量较正常组和假手术组显著增高(P0.01),而正常组与假手术组之间无差异(P0.05)。比较转染前后细胞PCNA表达量的变化,敲低TMEM16A基因的各组细胞PCNA表达量均显著下降(P0.01)。转染前分流组肺动脉平滑肌细胞的P-ERK/ERK较正常组和假手术组显著增高(P0.05),而正常组与假手术组之间差异无统计学意义(P0.05)。比较转染前后细胞P-ERK/ERK变化,敲低TMEM16A基因的各组细胞P-ERK/ERK均显著下降(P0.05)。结论：(1)TMEM16A促进大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖,从而参与高肺血流性肺动脉高压的发生。(2)TMEM16A促进大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖可能通过MAPK/ERK信号通路发挥作用。
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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R544.1

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