Anti-miR-21对eNOS表达调节和血管生成的影响及相关机制研究

发布时间：2018-05-30 14:01

  本文选题：Anti-miR-21 + 内皮型一氧化氮合酶　； 参考：《广西医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:前期研究发现,miR-21反义寡核苷酸(AS-miR-21)能显著抑制AP1和eNOS蛋白表达,转录因子AP1在AS-miR-21对eNOS的表达调节中起重要作用。进一步研究anti-miR-21对AngⅡ刺激下内皮型一氧化氮合酶基因表达调节的分子机制及其对体外血管形成的影响。1研究anti-miR-21对AngⅡ刺激下内皮型一氧化氮合酶基因表达调节的分子机制;2探讨anti-miR-21抑制AngⅡ刺激下内皮细胞增殖、迁移的机制及其对体外血管形成的影响;3阐明内皮细胞增殖、迁移和血管形成的分子机制,深入探讨anti-miR-21在心血管系统发育和心血管疾病中的作用。方法:1检测anti-miR-21对AngⅡ刺激人脐静脉内皮细胞eNOS和Ap1表达的影响构建anti-miR-21高表达质粒,通过X-treme GENE HP DNA转染试剂将anti-miR-21质粒转染入人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)内,根据实验目的将HUVECs分为3组:对照组、AngⅡ组和anti-miR-21+AngⅡ组。采用硝酸还原酶法检测细胞上清液的NO浓度;RT-PCR法分别检测eNOS和AP1 mRNA表达水平、免疫组化和免疫印迹实验(Western blotting)分别检测eNOS和AP1蛋白表达情况。2检测anti-miR-21对AngⅡ刺激下人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和血管形成的影响构建anti-miR-21高表达质粒,通过X-treme GENE HP DNA转染试剂将anti-miR-21质粒转染入人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)内,根据实验目的将HUVECs分为3组:对照组、AngⅡ组和anti-miR-21+AngⅡ组。观测HUVECs的增殖(四甲基偶氮唑盐,MTT法)、迁移(细胞划痕实验)、凋亡(流式细胞术)和血管形成(人工基底膜,Matrigel法)等生物学行为的改变。3检测anti-miR-21对AngⅡ刺激下人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和血管形成的分子机制构建anti-miR-21高表达质粒,通过X-treme GENE HP DNA转染试剂将anti-miR-21质粒转染入人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)内,根据实验目的将HUVECs分为3组:对照组、AngⅡ组和anti-miR-21+AngⅡ组。采用PCR法检测经AngⅡ刺激后miR-21的表达情况;采用免疫印迹实验分别检测CD31和VEGFR2蛋白表达情况。结果:1与对照组比较,AngⅡ组HUVECs的AP1与eNOS mRNA和蛋白表达均增加(P0.05),而转染anti-miR-21对其mRNA和蛋白表达都起到抑制作用(P0.05)。2与对照组比较,AngⅡ组细胞增殖明显上升(P0.05),迁移数目上升(P0.05),凋亡率下降(P0.05),形成管腔能力增强,而转染anti-miR-21均可对上述生物学行为起到抑制作用。3与对照组比较,Ang II刺激6h组和刺激24h组的miR-21 mRNA表达量均升高(P0.01),但随着刺激时间的增长,miR-21 mRNA表达量有所下降(P0.01);AngⅡ组HUVECs的CD31与VEGFR2蛋白表达均增加(P0.05),而转染anti-miR-21对其蛋白表达都起到抑制作用(P0.05)。结论:1 Anti-miR-21明显抑制AngⅡ刺激下HUVECs eNOS的表达;转录因子AP1的参与可能是这一调节过程的重要分子机制之一。2 Anti-miR-21明显抑制AngⅡ刺激下HUVECs的增殖、迁移、凋亡和血管形成能力,并且与其调控eNOS的表达有关。3 miR-21可能作为一个重要因子参与Ang II对内皮细胞血管生成的调节。
[Abstract]:Objective: Previous studies have found that miR-21 antisense oligonucleotides (AS-miR-21) can significantly inhibit the expression of AP1 and eNOS proteins. The transcription factor AP1 plays an important role in the regulation of AS-miR-21 on the expression of eNOS. The molecular mechanism of anti-miR-21 on the regulation of endothelial nitric oxide synthase gene expression under Ang II stimulation and its angiogenesis in vitro are further studied. The effect of.1 on the molecular mechanism of anti-miR-21 regulating the expression of endothelial nitric oxide synthase gene expression under Ang II stimulation; 2 to explore the mechanism of anti-miR-21 inhibition of proliferation and migration of endothelial cells under Ang II stimulated by Ang II and its effect on the angiogenesis in vitro; 3 to elucidate the molecular mechanism of endothelial cell proliferation, migration and angiogenesis, and to explore anti-mi in depth. The role of R-21 in cardiovascular system development and cardiovascular disease. Methods: 1 detect the effect of anti-miR-21 on the expression of eNOS and Ap1 in human umbilical vein endothelial cells stimulated by Ang II, construct a anti-miR-21 high expression plasmid and transfect anti-miR-21 plasmid into human umbilical vein endothelial cells through X-treme GENE HP DNA transfection reagent. In elial cells, HUVECs), HUVECs was divided into 3 groups according to the purpose of the experiment: the control group, the Ang II group and the anti-miR-21+Ang II group. The concentration of NO in the cell supernatant was detected by the nitrate reductase method; RT-PCR method was used to detect the eNOS and AP1 mRNA expression level. Immunohistochemistry and immunoblotting were used to detect the expression of the protein and the expression of the protein respectively. .2 detected the effect of anti-miR-21 on the proliferation, migration and angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells stimulated by Ang II to construct anti-miR-21 high expression plasmid and transfect anti-miR-21 plasmids into human umbilical vein endothelial cells via X-treme GENE HP DNA transfection reagent (Human umbilical vein). ECs was divided into 3 groups: control group, Ang II group and group anti-miR-21+Ang II. Observation of HUVECs proliferation (four methyl azazolate, MTT method), migration (cell scratch test), apoptosis (flow cytometry) and vascular formation (artificial basal membrane, Matrigel) and other biological behavior changes.3 detection anti-miR-21 on Ang II stimulation of human umbilical vein endothelial cells proliferation, Anti-miR-21 high expression plasmid was constructed by molecular mechanism of migration and angiogenesis. The anti-miR-21 plasmid was transfected into human umbilical vein endothelial cells via X-treme GENE HP DNA transfection reagent (Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs). The experimental purposes were divided into 3 groups: control group, group II and group II. CR was used to detect the expression of miR-21 after Ang II stimulation, and the expression of CD31 and VEGFR2 protein was detected by immunoblotting. Results: 1 compared with the control group, the AP1 and eNOS mRNA and protein expression of HUVECs in the Ang II group increased (P0.05), and the transfection anti-miR-21 played an inhibitory effect on the expression of the protein and the protein in the control group. The proliferation of cells in Ang II group increased significantly (P0.05), the number of migration increased (P0.05), the rate of apoptosis decreased (P0.05), and the capacity of the lumen increased, while anti-miR-21 transfected with anti-miR-21 could inhibit the biological behavior of the above-mentioned biological behavior compared with the control group. Ang II stimulated the 6h group and the stimulus 24h group of miR-21 mRNA. The expression of miR-21 mRNA decreased (P0.01), the CD31 and VEGFR2 protein expression of HUVECs in group Ang II increased (P0.05), and the transfection of anti-miR-21 on its protein expression was inhibited (P0.05). Conclusion: 1 Anti-miR-21 obviously inhibited the expression of Ang II stimulated. .2 Anti-miR-21, one of the important molecular mechanisms of the process, obviously inhibits the proliferation, migration, apoptosis and angiogenesis of HUVECs stimulated by Ang II, and that.3 miR-21 may be an important factor involved in the regulation of Ang II on the angiogenesis of endothelial cells.
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54

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本文编号：1955555