ST6GAL-Ⅰ调节β-Catenin的唾液酸化在炎症诱导血管内皮损伤过程中的作用与机制

发布时间：2018-06-13 01:18

本文选题：动脉粥样硬化 + 肿瘤坏因子α　；参考：《重庆医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种累及大中动脉的慢性炎症性疾病[1-3],在其发生早期即单核细胞浸润内皮过程中涉及多种糖蛋白参与,但其具体机制尚不清楚。以往研究大多关注该过程黏附分子的表达情况,而对相关蛋白分子的蛋白质翻译后修饰对其影响的研究相对较少。故本课题将重点探讨动脉粥样硬化发生早期糖基化修饰水平的改变以及β-Catenin的α-2,6唾液酸化作用与单核细胞穿透内皮细胞的相关性及分子机制,从而揭示糖基转移酶ST6Gal-?在动脉粥样硬化发生、发展及消退过程的表达规律及生物功能,为今后动脉粥样硬化的防治提供新的思路。第一部分ST6Gal-Ⅰ参与动脉粥样硬化形成、进展及消退过程ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化形成、进展及消退过程与ST6Gal-Ⅰ基因表达实验目的:以ApoE~(-/-)小鼠为研究对象,高脂喂养小鼠构建动脉粥样粥样硬化发生、发展及药物干预消退模型,初步确定动脉粥样硬化发展过程与唾液酸转移酶(ST6Gal-Ⅰ)的表达相关性。实验方法:1.采用高脂喂养ApoE~(-/-)小鼠16周,构建动脉粥样硬化发生组(基线模型组,baseline)、高脂喂养23周(发展组,development)及高脂喂养23周同时后7周给予瑞舒伐他汀灌胃处理(消退组,regression)。2.常规生化分析血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)。3.油红O检测主动脉根部斑块面积大小。4.HE检测主动脉根部病理变化。5.免疫组化检测主动脉根部糖基转移酶ST6Gal-Ⅰ的表达。实验结果:1.ApoE~(-/-)小鼠经高脂饲料喂养后,动脉粥样硬化发展组与基线组相比,随着高脂饲料喂养周数的增加,小鼠血清中LDL-C、HDL-C、TC、TG水平均升高,其中LDL-C及TG变化具有显著性差异(P(27)0.05);消退组与发展组比较,LDL-C、TG水平均明显下降,并有统计学差异(P(27)0.05)。血脂四项结果初步提示动脉粥样硬化发生、发展及消退模型构建成功。2.油红O染色结果显示,发展组小鼠主动脉根部斑块面积大小明显高于基线组(P(27)0.05),消退组明显低于发展组(P(27)0.05)。各组小鼠主动脉根部斑块面积大小结果进一步提示动脉粥样硬化发生、发展及消退模型构建成功。3.HE染色显示与基线组相比动脉粥样硬化发展组内膜排列紊乱且异常增生,厚度明显高于基线组(P(27)0.05),消退组明显低于发展组(P(27)0.05)。表明动脉粥样硬化发生、发展及消退模型构建成功。4.动脉粥样硬化发展组内膜ST6Gal-Ⅰ的表达明显高于基线组,消退组ST6Gal-Ⅰ的表达较发展组出现明显的回升。实验结论:动脉粥样硬化发生、发展及消退过程可能与糖基转移酶ST6Gal-Ⅰ表达密切相关。第二部分TNF-α通过ST6GAL-?影响内皮细胞中功能蛋白唾液酸化,进而影响单核穿透内皮细胞的功能实验目的:以人脐静脉内皮细胞株EA.hy926为研究对象,TNF-α刺激内皮细胞构建动脉粥样硬化炎症损伤体外模型,分析在炎症作用下内皮细胞ST6Gal-Ⅰ表达及单核细胞穿透内皮功能的变化。实验方法:1.采用台盼蓝染色法,验证TNF-α对内皮细胞存活率的影响。2.Western blot、免疫荧光及流式细胞术检测TNF-α处理后,EA.hy926细胞中ST6Gal-Ⅰ及总蛋白的α-2,6唾液酸化水平的变化情况。3.单核-内皮细胞transwell小室三维立体共培养验证TNF-α处理EA.hy926细胞后,单核细胞穿透内皮细胞功能的影响。4.利用si RNA构建ST6Gal-Ⅰ的瞬时干扰模型,WB及流式细胞术验证模型是否构建成功。5.ST6Gal-Ⅰ干扰后,验证单核穿透内皮细胞功能变化。6.Western blot检测TNF-α处理EA.hy926细胞对FAK信号通路的影响。实验结果:1.与对照组相比,TNF-α在0-50ng/ml浓度范围处理EA.hy926对细胞的存活率基本无影响。2.与对照组相比,TNF-α处理EA.hy926细胞后,WB结果显示细胞中ST6Gal-Ⅰ表达水平均明显下降,SNA-blot结果显示,细胞中总唾液酸化蛋白均呈下降趋势,且在10-20ng/ml具有统计学差异(P(27)0.05)。免疫荧光及流式的结果均显示TNF-α刺激EA.hy926细胞后,细胞表面SNA标志蛋白明显下降。3.在transwell小室共培养单核-内皮细胞模型中,与对照组相比,随着TNF-α浓度的升高,荧光标记的单核细胞穿透内皮细胞细胞数量逐渐增多,酶标仪检测下槽的荧光强度值也是逐渐增强的(P(27)0.05),表明单核细胞穿透内皮细胞功能明显增强。4.si RNA干扰后,细胞中ST6Gal-?、SNA标志蛋白表达及流式检测细胞表面SNA标志蛋白水平均明显低于对照组(P(27)0.05)。且单核细胞穿透内皮细胞数量明显增多,transwell下室单核细胞的荧光强度明显增强(P(27)0.05)5.Western blot检测显示,TNF-α处理EA.hy926细胞FAK磷酸化水平明显上升。实验结论:TNF-α诱导EA.hy926细胞ST6Gal-?及总蛋白的α-2,6唾液酸化水平明显下降,且单核穿透内皮细胞的功能明显增强,即内皮细胞遭到破坏。第三部分ST6Gal-?调控β-Catenin唾液酸化的分子机制实验目的:以EA.hy926为研究对象,TNF-α刺激内皮细胞构建动脉粥样硬化炎症损伤体外模型,分析在炎症作用下与紧密连接相关的蛋白是否发生α-2,6唾液酸化及细胞之间紧密连接的变化。实验方法:1.采用免疫共沉淀及免疫印迹法,验证TNF-α对内皮细胞紧密连接相关蛋白的α-2,6唾液酸化的影响。2.免疫荧光进一步验证细胞膜表面靶蛋白β-catenin的α-2,6唾液酸化水平。3.电镜观察正常组、炎症刺激组及过表达ST6Gal-?炎症刺激组细胞与细胞之间紧密连接的变化。实验结果:1.IP结果显示,炎症刺激前后Integrinα5、N-Cadherin、p-β-Catenin和β-Catennin本身的表达量并未发生明显变化,Integrinα5和N-Cadherin的α-2,6唾液酸化水平也未发生改变,而p-β-Catenin和β-Catennin的α-2,6唾液酸化水平相对于对照组明显下降。2.免疫荧光结果显示,炎症刺激内皮后,细胞膜表面p-β-Catenin的完整性遭到破坏。3.电镜结果显示,对照组内皮细胞间连接紧密,炎症刺激后,内皮细胞紧密连接变得松散,紧密连接结构遭到了破坏,而在过表达ST6Gal-?同时给予炎症刺激时,与炎症组相比,细胞之间的紧密连接出现了明显的回复现象,细胞与细胞之间的连接变得紧密了。实验结论:EA.hy926细胞与细胞之间紧密连接的变化可能是由ST6Gal-?催化β-Catenin的α-2,6唾液酸化引起的。
[Abstract]:This study focused on the changes of atherosclerotic formation , progression and regression , and the mechanism of molecular mechanism . The results showed that the changes of the early glycosylation modification level of atherosclerosis and the expression of 伪 - 2,6 Sialic acid and the mechanism of molecular mechanism were studied .
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.5

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