通络干预对高血压病靶器官损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2018-06-24 02:30

  本文选题：高血压病 + 心肌纤维化　； 参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景高血压性心脏病是高血压病患者主要的心脏并发症之一,与心律失常和冠状动脉硬化性心脏病密切相关,是心力衰竭的最常见病因之一。经典的观点认为因为血压持续升高、机械刺激导致心室压力超负荷引起代偿性肥大,细胞水平表现为心肌细胞的肥大和细胞表型的改变,最终影响到心脏的收缩功能导致心力衰竭。流行病学调查显示左室肥大是心力衰竭的独立危险因素；但是,尽管抗高血压治疗策略及针对心肌保护的措施在持续更新,高血压患者心力衰竭的发病率与其他主要的心血管事件一样,仍然居高不下。而近来的基础研究和临床研究显示,细胞外基质的沉积和转换异常是高血压导致的靶器官损伤的病理生理学基本机制中的关键因素。高血压引起的心室压力超负荷会引起心肌成纤维细胞表型改变而转化为肌成纤维细胞,并在心脏中产生细胞外基质的过量累积最终导致心肌纤维化。高血压病患者心肌活检中证实有明显而广泛的心肌间质胶原纤维沉积和各型胶原比例失调。而心肌纤维化会导致心室壁僵硬度增加,心室顺应性下降,病程早期即可以首先引起舒张功能障碍；而持续的压力超负荷最终可能导致心室重塑由向心性肥厚转向离心性肥厚,心室扩张,功能失代偿从而导致舒张性和／或收缩性心力衰竭。因此,防治心肌纤维化对于控制高血压性心脏损害的发展及改善疾病预后有着重要的意义。但是,临床缺乏有效而安全的抗心肌纤维化的治疗药物,所以,寻找抗纤维化的有效治疗靶点是基础研究和临床实践亟需解决的问题。心脏是由多种细胞构成的有机整体。有学者应用荧光分选系统分析心脏细胞论文Ⅰ通心络对高血压病心肌纤维化的作用及机制研究(细胞实验)类型显示：心肌细胞占56%,心肌成纤维细胞占27%,心脏微血管内皮细胞占7%,血管平滑肌细胞占10%；此外,还存在免疫细胞。不同细胞在心脏中承担着不同的作用与功能,而且,越来越多的学者认为,心脏细胞通过直接的或间接的交流构成的心脏(细胞)微环境,在各种心脏疾病病理生理机制的形成和发展中起到了重要作用；有专家认为成功的心脏修复和再生策略有赖于心脏微环境的精细定量调控。比如,应用干细胞对心脏疾病的治疗时,干细胞类生物制剂必须.卜心脏移植部位微环境进行竞争,甚至实现逆转病理环境,才能有效地改善心肌的微环境,以可以提高干细胞治疗的效果。又比如在合适的细胞微环境中,心肌成纤维细胞可以重编程为心肌样细胞而补充损失的心肌细胞。对于心肌纤维化的发生发展而言,心脏细胞间相互作用和微环境的作用同样重要。首先,不同的心脏细胞可以改变各自的生物学行为；其次,心脏细胞通过自分泌、旁分泌细胞因子的形式介导细胞间交流；第三,细胞间存在交互通话,如细胞—细胞或细胞—基质通过粘附因子接触、缝隙连接介导进行细胞内分子转移等。所以,心脏细胞间的相互作用及其构建的微环境,通过以上途径,参与了心肌纤维化的进程；同时,这些机制给临床治疗带来了新的启示。目前,随着对心脏非心肌细胞的认识深入,非心肌细胞的功能被认为是心脏病理生理机制的“集线器”。其中,心肌成纤维细胞和心脏微血管内皮细胞的重要性得到了越来越多的关注。首先,心肌成纤维细胞是形成心肌纤维化的首要效应细胞,其主要功能是负责合成细胞外基质蛋白和维持细胞外基质的稳态。在心脏中,成纤维细胞发生表型变化而转化为肌成纤维细胞,在心脏中产生细胞外基质的过量累积是心肌纤维化的关键细胞事件,是高血压性心脏病的早期事件,也代表着心脏纤维化导致病理性心脏重塑和功能障碍的关键事件。此外,心肌肌成纤维细胞的异源性提示心脏纤维化的形成可能是心脏微环境与不同类型细胞之间的交互作用异常而导致的。目前已知的心肌肌成纤维细胞的来源尚有争议：心脏丰富的原位成纤维细胞被认为是肌成纤维细胞的主要来源；骨髓起源的循环纤维细胞和由心脏微血管内皮细胞间充质转化都被报道可以形成心肌肌成纤维细胞。因此,对于心肌纤维化的治疗首要的和基本的措施是抑制心肌成纤维细胞的表型转化和纠正心肌成纤维细胞的异常生物学行为和功能。其次,在血流动力学异常、机械应力刺激、神经-体液调节机制紊乱和心脏微环境稳态失衡等病理情况时,心脏微血管内皮细胞是最早感受到病理性刺激并做出反应的细胞,也是损伤最早的细胞。心脏微血管内皮细胞损伤与活化可能是心脏疾病的最初表现,血管生成功能障碍是最常见的血管损伤的表现。而在应激或细胞因子活化的内皮细胞与可以与成纤维细胞相互作用,与纤维生成反应密切相关：合成与释放炎症因子(如TNFa和IL-6)；合成与释放促纤维化生成的介质(如CTGF和TGFβ1);异常的氧化还原状态；内皮细胞间充质转化为成纤维细胞。因此,保护心脏微血管内皮细胞功能,抑制内皮细胞活化,调控微血管内皮细胞和心肌成纤维细胞的异常生物学行为,维持心脏微环境稳态,同样也是心肌纤维化的重要靶点。miRNA是生物内源性的单链小分子RNA,并不编码蛋白质,主要的作用机制是通过与靶基因的mRNA 3'端非翻译区(3’UTR)按碱基互补配对的原则结合,从而促进靶基因mRNA降解或者抑制靶基因mRNA翻译,从而在转录后水平负性调控靶基因表达。miRNA可以直接调节细胞生物学行为,包括细胞的增殖、凋亡及分化等,广泛参与生命进程及疾病的发生发展中；也可以借助细胞外来体(exosome)作为载体进行信息传递,参与调控细胞微环境. miRNA为我们认识心脏正常发育和疾病机制提供了新的思路。miR-133a诱导干细胞向心肌细胞的分化,调控心脏形态的发育；miR-133a可以表达在心肌细胞、心肌成纤维细胞和内皮细胞,直接参与调控与心室重塑、心肌纤维化和血管生成直接相关的信号通路；在病理条件下miR-133a对心脏结构和功能能够发挥保护性作用。因此,调节miR-133a的表达,调控心脏细胞的生物学行为以及与之相关的信号通路,被认为是有效治疗心肌纤维化的可能分子靶点。通心络胶囊,是基于中医络病学说制定的通络干预的代表方剂。近二十年以来,通心络胶囊临床广泛运用于心脑血管疾病,包括心绞痛、动脉粥样硬化、高血压和脑梗塞等。基础研究显示通心络胶囊的药理作用机制具有多效性,包括抗炎、抗氧化、抗纤维化等。因而,通心络胶囊被认为是部分心血管疾病的替代性或补充性治疗,甚至可作为基础治疗。从已发表的研究成果和文献分析,微血管和血管内皮细胞是通心络作用的重要靶点。同时在基础研究和动物实验中的证据显示,通心络对于心脏纤维化和肾脏纤维化有抗纤维化作用；如我们前期的实验显示通心络胶囊减轻了自发性高血压大鼠的心脏重塑。但是,目前研究都缺乏对通心络胶囊抗纤维化的作用机制研究。因为高血压病导致心脏压力超负荷会引起心脏局部和全身循环内Ang II的水平升高；而Ang II是明确的心脏促纤维生成因子和促炎症因子,可以通过TGFβ1/Smad3或IL-6/ERK途径活化心肌成纤维细胞,并诱导胶原蛋白的表达,是引起高血压病心肌纤维化发生和进展的重要因素。在本部分的研究中,我们使用了AngⅡ干预的原代心肌成纤维细胞和原代心脏微血管内皮细胞体外模拟和观察高血压病心肌纤维化的病理状态下的细胞生物反应以及通心络干预的影响；假设miR-133a可能是通心络发挥抗心肌纤维化作用的重要靶点并在实验中进行相应的干预研究。研究目的：1.观察通心络对Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞表型转化和功能异常的影响；2.观察通心络对Ang Ⅱ引起的心脏微血管内皮细胞损伤和活化的影响,以及对心脏细胞微环境的调节；3.探讨通心络发挥作用的具体机制,以及与miR-133a的关系。研究方法1.原代心肌成纤维细胞和心脏微血管内皮细胞分离、鉴定和培养利用酶消化法和差速分离技术自Wistar乳鼠(出生1-3天内)的心脏分离原代心肌成纤维细胞和心脏微血管内皮细胞。分别利用成纤维特异性蛋白(FSP)-1抗体、乙酰化低密度脂蛋(DiI-ac-LDL)抗体和CD3 1抗体进行细胞免疫荧光染色以鉴定心肌成纤维细胞和心脏微血管内皮细胞。取生长状态良好的第2-3代细胞进行实验。2.筛选通心络溶液对细胞活性作用的合适浓度区间和时间采用CCK-8方法进行细胞活性检测,以分别筛选通心络溶液对心肌成纤维细胞和心脏微血管内皮细胞作用的合适浓度区间和时间。3.心肌成纤维细胞的分组与干预(1)观察通心络对Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞转化的影响以及其筛选最佳作用浓度：分为空白对照组(control组)、阳性对照组(Ang Ⅱ组)、各实验组(Ang Ⅱ+不同浓度通心络溶液)。按分组仅给予培养基或给予培养基、通心络溶液和／或AngⅡ 100 nM刺激24小时。提取蛋白,检测a-SMA蛋白表达,观察通心络对心肌成纤维细胞的表型转化的影响。(2)根据干预因素分组：分为空白对照组(control组)、阳性对照组(Ang Ⅱ组)、阴性对照组(negative control组,Ang Ⅱ+Scrambled siRNA转染+通心络)和实验组(treat组,Ang II+miR-133a inhibitors转染+通心络)。4.心脏微血管内皮细胞的分组与干预(1)确定通心络对Ang Ⅱ损伤的心脏微血管内皮细胞的体外成管功能的影响以及其筛选最佳作用浓度：分为空白对照组(control组)、阳性对照组(Ang Ⅱ组)、各实验组(Ang Ⅱ+不同浓度通心络溶液)。按分组仅给予培养基或给予培养基、通心络溶液和／或Ang Ⅱ100 nM刺激24小时。观察通心络对心脏微血管内皮细胞的体外成管功能的影响。(2)根据干预因素分组：分为空白对照组(control组)、阳性对照组(Ang Ⅱ组)、阴性对照组(negative control组,Ang Ⅱ+Scrambled siRNA转染+通心络)和实验组(treat组,Ang II+miR-133a inhibitors转染+通心络)。5. miR-133a inhibitors的转染方法使用Lipofectamine 2000将miR-133a inhibitors转染入心肌成纤维细胞和心脏微血管内皮细胞以实现miR-133a沉默,以scrambled siRNA作为阴性对照组。实时定量逆转录PCR测定miR-133a表达水平以检测转染效果。6.心肌成纤维细胞转化和功能检测利用免疫蛋白印迹检测a-SMA的表达观察心肌成纤维细胞的表型转化。利用Transwell小室观察心肌成纤维细胞的迁移能力的变化。利用3H脯氨酸掺入实验检测心肌成纤维细胞胶原合成能力的变化。利用酶联免疫吸附法检测心肌成纤维细胞培养基上清中Ⅰ型胶原(collagen I)、白介素-6分析心肌成纤维细胞分泌功能的变化。7.心脏微血管内皮细胞功能损伤和活化的检测利用基质胶成管实验观察心脏微血管内皮细胞体外成管功能。利用ELISA检测细胞上清中白介素-6和结缔组织生长因子分析心脏微血管内皮细胞分泌功能的变化。利用硝酸还原酶法检测心脏微血管内皮细胞一氧化氮(nitric oxide, NO)的含量。8.实时定量逆转录PCR(real-time quantitative RT-PCR)。使用Trizol提取各组细胞总RNA,进行逆转录和实时定量PCR检测细胞中的mRNA表达水平。使用mirVanarTM miRNA提取试剂盒提取各组细胞的miRNAs,并进行逆转录,应用荧光标记的miR-133a特异性探针,检测细胞中miR-133a的表达水平。9.收集各组细胞提取蛋白,分别检测a-SMA、Smad3、p-Smad3、CTGF、 caveolin-1、eNOS、p-eNOS蛋白表达水平的变化。10.统计学分析应用SPSS 18.0软件分析处理数据,各种独立实验至少重复3次,数据以均数士标准误表示。两组比较采用t检验；组间比较使用单因素方差分析法。以P0.05被认为有统计学意义。研究结果1.通心络抑制了AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞的表型转化(1)通心络作用于心肌成纤维细胞的适宜浓度范围和时间的筛选浓度在400μg/mL以内的通心络溶液是实验的适宜浓度范围；24 h对细胞活力影响最小。(2)通心络抑制了AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞的a-SMA蛋白的表达。与空白对照组比较,Ang Ⅱ显著增加了心肌成纤维细胞a-SMA的表达水平而不同浓度的通心络均显著抑制了Ang Ⅱ诱导心肌成纤维细胞的a-SMA表达；通心络在400μg/mL的浓度时产生了最大的抑制作用,该浓度作为心肌成纤维细胞后续实验的适宜浓度。(3)通心络抑制了AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞的功能活化。与空白对照组比较,AngⅡ显著增加了心肌成纤维细胞3H-羟脯氨酸掺入量；通心络显著抑制了AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞3H-羟脯氨酸掺入量。与空白对照组比较,AngⅡ显著增加了心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原和1L-6的分泌；通心络显著抑制了AngⅡ诱导的1型胶原和IL-6的分泌。与空白对照组比较,AngⅡ显著增加了心肌成纤维细胞迁移能力；通心络显著抑制了AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞迁移能力。(4)通心络对AngⅡ作用下心肌成纤维细胞miR-133a的表达水平的影响与空白对照组比较,AngⅡ作用下,心肌成纤维细胞中miR-133a的表达水平显著降低。不同浓度的通心络均显著改善miR-133a的表达；通心络在400μg/mL的浓度时产生了最大的作用。(5)通心络通过调节miR-133a表达抑制了AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞表型转化对于转染miR-133a抑制物的心肌成纤维细胞,通心络抑制了AngⅡ诱导的转化；而对于转染scrambled siRNA的心肌成纤维细胞的表型转化仍存在抑制作用。(6)通心络通过调节miR-133a表达抑制了Ang II诱导的心肌成纤维细胞Smad3/CTGF信号通路的活化与空白对照组比较,Ang II诱导心肌成纤维细胞的Smad3磷酸化水平明显上调并且显著增加了CTGF的表达。对于转染miR-133a抑制物的心肌成纤维细胞,通心络没有抑制AngⅡ诱导上调的Smad3磷酸化水平和CTGF的表达水平,而对于转染scrambled siRNA的CFs仍存在抑制作用。2.通心络改善了AngⅡ诱导的心脏微血管内皮细胞的损伤和活化(1)通心络作用于心脏微血管内皮细胞的适宜浓度范围和时间的筛选使用浓度在400μg/mL以内的通心络溶液是实验的适宜浓度范围。同时,结果显示400μg/mL的通心络在24h内对细胞活性无显著影响。(2)通心络改善了AngⅡ损伤的心脏微血管内皮细胞的体外成管功能与空白对照组比较,AngⅡ显著抑制了心脏微血管内皮细胞的体外成管功能。不同浓度的通心络均显著改善了心脏微血管内皮细胞的成管功能；通心络在400μg/mL的浓度时产生了最大的作用。(3)通心络对AngⅡ作用下的心脏微血管内皮细胞NO含量以及CTGF和IL-6分泌的影响空白对照组比较,AngⅡ显著减少心脏微血管内皮细胞的NO含量并增加了CTGF和IL-6分泌量；而通心络干预显著增加了NO含量并减少了CTGF和IL-6分泌量。(4)通心络对AngⅡ作用下心脏微血管内皮细胞miR-133a的表达水平的影响Ang Ⅱ作用下,心脏微血管内皮细胞中miR-133a的表达水平显著降低。不同浓度的通心络均显著恢复miR-133a的表达水平；通心络在400μg/mL的浓度时产生了最大的作用。(5)通心络通过调节miR-133a表达而改善了AngⅡ损伤的心脏微血管内皮细胞体外成管功能对于转染miR-133a抑制剂的心脏微血管内皮细胞,通心络未能改善Ang Ⅱ损伤的成管功能；而对转染scrambled siRNA的心脏微血管内皮细胞成管功能,通心络仍存在改善作用。(6)通心络通过调节miR-133a抑制了AngⅡ诱导心脏微血管内皮细胞的小窝蛋白(caveolin, cav)-1的表达并促进了eNOS的活化与空白对照组比较,AngⅡ诱导心脏微血管内皮细胞cav-1的表达上调并降低了eNOS磷酸化水平。对转染miR-133a抑制剂的心脏微血管内皮细胞,通心络失去了对eNOS磷酸化水平和cav-1表达的调节作用；而对转染scrambled siRNA的心脏微血管内皮仍存在调节作用。研究结论1.通心络抑制了AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞表型转化和功能活化,其作用与促进miR-133a表达、抑制促纤维生成相关的信号通路Smad3/CTGF有关；2.通心络保护了Ang Ⅱ损伤的心脏微血管内皮细胞的功能状态,其作用与促进miR-133a表达、抑制caveolin-1表达、活化血管内皮保护相关的信号通路eNOS/NO有关；3.通心络抑制了心脏微血管内皮细胞的活化,改善了其异常代谢与分泌功能,从而调节了促心肌成纤维细胞活化和促纤维形成的细胞微环境。研究背景高血压性心脏病是高血压病患者主要的心脏并发症之一；而心肌肥大一直被认为是高血压心脏病最重要的病理变化,是导致心力衰竭的独立危险因素。尽管抗高血压治疗策略及针对心肌保护的措施在持续更新,高血压患者心力衰竭的发病率与其他主要的心血管事件一样,仍然居高不下。近年来,基础与临床研究显示心脏细胞外基质的过量沉积和转换异常导致的心肌纤维化,可能是高血压病导致的心脏结构和功能损伤的病理生理学基本机制中的关键因素。高血压病患者心肌活检中证实有明显而广泛的心肌间质胶原纤维沉积和各型胶原比例失调。高血压或主动脉硬化出现的心脏压力超负荷可以引起心肌纤维化,从而导致心室壁僵硬度增加,心室顺应性下降,病程早期即可以首先出现舒张功能障碍；而持续的压力超负荷最终可能导致心室重塑由向心性肥厚转向离心性肥厚,心室扩张,功能失代偿从而导致舒张性和／或收缩性心力衰竭。因此,防治心肌纤维化对于控制高血压性心脏结构和功能损害的进展及改善疾病预后起了重要作用。近年来,心脏微血管和微血管内皮细胞对心肌纤维化的重要作用开始引起了人们的关注。组织病理学显示,心脏纤维化反应与微血管生成的反应的频繁共存,而心脏压力超负荷的情况下往往发生明显的血管周围纤维化；这些变化也提示了心肌纤维化往往涉及到心脏微血管的改变。微血管生成是心脏应对应激的代偿性机制。病理刺激如高血压带来的异常血流动力学变化、缺血和缺氧、慢性神经-论文Ⅱ通心络对高血压病心肌纤维化的作用及机制研究(动物实验)体液的高反应性能调节心脏内微血管的生长,以适应肥大的心脏对氧气和营养日益增加的需求。在高血压病动物模型中,病程早期对于心脏微血管生成的描述存在分歧,比如,有人观察到SHR心脏微血管密度的增加,尤其是在生长的早期；但是更多的实验提示,成年自发性高血压大鼠的心、脑、肾等器官往往存在的微血管稀疏的情况。在病程中后期发生明显心肌纤维化或发生显著的心功能改变的时候,血管生成代偿性的增强对病理刺激的反应往往是不充分的。因此,对于肥大的心肌细胞增加的氧及能量的需求而言,微血管生成数量是相对不充足的；在血管网络的改造过程中还存在微血管的破坏或退化,所以微血管的结构和功能并不完善。同时,损伤还引起微血管内皮活化,代谢异常以及旁分泌和内分泌功能活跃,导致心脏炎症和氧化应激反应,形成促纤维生成的心脏微环境。病理性微血管的生成并没有明显改善心脏的供血与供氧,其结局是进一步加重心脏代偿性的功能和结构重塑而向心衰转化。有人推测血管生成功能障碍导致的微血管稀疏可能是高血压病的重要特征之一,并且可作为预测心功能失代偿的重要指标。因此,改善心脏微血管生成和纠正微环境紊乱,对于减轻心肌纤维化与保护心功能有重要意义。miRNA是生物内源性的非编码单链小分子RNA,主要通过与靶基因的mRNA3'端非翻译区(3’UTR)按碱基互补配对的原则结合,促进靶基因mRNA降解或者抑制靶基因mRNA翻译,从而在转录后水平负性调控靶基因表达。microRNA-133a是心脏的表达较为丰富的miRNA,可以表达在心脏的多种细胞中,如心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞等。miR-133a广泛地参与了心脏发育和疾病的发生发展。在胚胎发育阶段miR-133a诱导干细胞向心肌细胞的分化并调控心脏形态的发育；miR-133a基因敲除小鼠的心脏存在室间隔缺损、室壁变薄、心室扩张、心功能减退等表现,同时还可见广泛的纤维化。在多种心肌重构动物病理模型中,如经主动脉缩窄术引起心室压力超负荷的动物模型、自发性高血压大鼠、AngⅡ持续给药造模或肾素-2转基因的高血压大鼠,表现出心室肥厚、心肌纤维化和心力衰竭以及伴随减少的心脏miRNA-133a表达。在人类发生病理性重构的心室中也出现了miRNA-133a的表达下调。在动物模型中应用miR-133a过表达可以阻止心肌纤维化的进展。因此,调节miR-133a及其下游靶基因相关的信号分子的表达,对于高血压病心肌纤维化的治疗有良好的应用前景。高血压病心肌纤维化是高血压病缓慢进展的病程中出现的心脏并发症；是心络病变由气到血,并在络脉病变的基础上出现的脏器实质性病变符合中医“久病入络”与“久瘀入络“观点。它是由于致病因素引起了心络主持营卫气血交互生化的功能障碍,导致心络气血壅滞,体用俱损,与继发性产生的痰浊瘀毒相互影响,络息成积,致使心脏发生病理改变。所以,通络干预,恢复“络以通为用”,是切合高血压病心肌纤维化病机的治法。通心络胶囊,是基于中医络病学说制定的通络干预的代表方剂。近二十年以来,通心络胶囊临床广泛运用于心脑血管疾病,包括心绞痛、动脉粥样硬化、高血压和脑梗塞等。近来,来自基础研究和动物实验中的证据显示,通心络对于心脏纤维化和肾脏纤维化有抗纤维化作用；我们前期的实验显示通心络胶囊减轻了自发性高血压大鼠的心脏重塑。但是都缺乏对通心络胶囊抗纤维化的作用机制研究。在上一部分实验中,我们证实通心络在体外抑制了心肌成纤维细胞的转化和功能活化、保护了心脏微血管内皮细胞的功能并改善了细胞微环境,其作用通过调节miR-133a表达及相关信号通路有关,可能是其体内抗心肌纤维化的重要机制。为了证实这个假设,我们使用自发性高血压大鼠作为模型,观察了通心络在体内对心肌纤维化的影响及其作用机制。研究目的：1.观察通心络对自发性高血压大鼠的心肌纤维化和与促纤维生成的心脏微环境(微血管生成和炎症反应)的影响；2.探讨通心络在自发性高血压大鼠体内作用机制,及与miR-133a的关系。研究方法1.实验动物的分组将40只8周龄雄性SHR随机分为通心络不同剂量治疗组即高剂量治疗组、中剂量治疗组和低剂量治疗组,以及阳性对照组,每组各10只。10只8周龄雄性Wistar大鼠作为正常对照组。2.血压和心功能的测量采用无创血压计测量大鼠尾动脉压；采用二维、M超、组织多普勒和脉冲多普勒超声成像技术评价大鼠左室舒张和收缩功能。3.组织病理学分析将大鼠心脏标本制备为石蜡切片,进行心肌胶原的Masson染色,并计算胶原胶原容积分数。应用免疫组织化学染色,观察心脏组织CD31的表达并计算心脏微血管密度。4.实时定量逆转录PCR收集各组别的组织并提取miR-133a,进行逆转录和实时定量PCR,检测组织中miR-133a表达水平。5.蛋白印迹收集各组别的细胞及组织并提取蛋白,分别检测Ⅰ型胶原、Smad3、p-Smad3. CTGF、eNOS、p-eNOS和VEGF-A等蛋白的表达水平。6.NO含量以及IL-6和TNFα的测定利用ELISA检测心脏组织IL-6和TNFα。利用硝酸还原酶法心脏组织NO的含量。7.统计学分析应用SPSS 18.0软件分析处理数据,数据以并以均数士标准误表示。两组比较采用t检验；组间比较使用单因素方差分析法。以P0.05被认为有统计学意义。研究结果1.通心络降低了SHR的收缩压SHR组及通心络不同剂量组血压显著高于WKY组；与SHR比较,通心络治疗显著抑制了SHR血压升高的趋势。各不同剂量治疗组间没有显著性差异。2.通心络改善了SHR心脏舒张功能SHR组及通心络不同剂量组的左室舒张功能E/A值、左室壁动度E'/A'值显著低于WKY组。与SHR组比较,通心络不同剂量组的E/A值、E'/A'值显著升高。但各剂量组间并没有显著差异。与WKY组比较,SHR组及通心络不同剂量组的EF及FS值无显著差异。3.通心络减轻了SHR心肌纤维化程度SHR组及通心络不同剂量组的胶原容积分数明显高于WKY组。与SHR组比较,通心络不同剂量组的CVR显著降低；但各剂量组间并没有显著差异。SHR组及通心络不同剂量组的Coll的表达明显高于WKY组。与SHR组比较,通心络不同剂量组的ColⅠ的表达显著降低；但各剂量组间并没有显著差异。SHR组及通心络不同剂量组的a-SMA的表达明显高于WKY组。与SHR组比较,通心络不同剂量组的a-SMA的表达显著降低(p0.05)；但各剂量组间并没有显著差异。4.通心络增加了SHR心脏微血管密度SHR组及通心络不同剂量组的MVD明显低于于WKY组。与SHR组比较,通心络不同剂量组的MVD显著升高；但各剂量组间并没有显著差异。5.通心络增加了SHR心脏的NO含量SHR组及通心络不同剂量组的心脏NO含量明显低于于WKY组。与SHR组比较,通心络不同剂量组的心脏NO含量显著升高；但各剂量组间并没有显著差异。6.通心络减少了SHR心脏炎症因子IL-6和TNFa的表达SHR组及通心络不同剂量组的IL-6和TNFa表达明显低于于WKY组。与SHR组比较,通心络不同剂量组的IL-6和TNFa表达显著升高；但各剂量组间并没有显著差异。7.通心络增加了SHR心脏miR-133a表达SHR组及通心络不同剂量组的miR-133a表达水平明显低于于WKY组。与SHR组比较,通心络不同剂量组的miR-133a显著升高；但各剂量组间并没有显著差异。8.通心络降低了SHR心脏Smad3的磷酸化水平和CTGF的表达SHR组及通心络不同剂量组Smad3的磷酸化水平和CTGF的表达显著高于WKY组。与SHR组比较,通心络不同剂量组的心脏Smad3的磷酸化水平和CTGF的表达显著降低：但各剂量组间并没有显著差异。9.通心络减少了SHR心脏caveolin-1的表达并增加了eNOS的磷酸化水平SHR组及通心络不同剂量组心脏的caveolin-1表达水平明显高于WKY组。与SHR组比较,通心络不同剂量组的caveolin-1表达水平的表达显著降低；但各剂量组间并没有显著差异。SHR组及通心络不同剂量组心脏的eNOS磷酸化水平明显低于于WKY组。与SHR组比较,通心络不同剂量组)的eNOS磷酸化水平的表达显著升高；但各剂量组间并没有显著差异。研究结论1.通心络可以改善高血压病心肌纤维化,以及通过增加心脏微血管密度和减轻心脏炎症水平,纠正了促纤维生成的心脏微环境改变,从而较好的改善了心脏的功能和结构重塑；2.在体外实验的基础上,动物实验证实了通心络可以调节SHR心脏miR-133a的表达水平,并影响miR-133a调控的下游靶基因相关的促纤维化和促血管生成相关的信号通路；3.以通心络为代表的通络干预适用于心肌纤维化的治疗。论文Ⅲ通心络对高血压病肾损害的作用及机制研究研究背景高血压病是严重危害人类健康的常见病,其引起的心脑血管及肾等重要脏器损伤导致的并发症致残及致死率高,已成为全球范围的重要公共卫生议题。流行病学调查发现,我国高血压病患病率有上升趋势。因为肾脏不仅是高血压影响的重要靶器官,也是血压调节的重要器官,未经控制的高血压病患者发生肾功能不全的比例约为18%；据美国肾脏数据系统统计,高血压病是引起终末期肾病的比例高达30%。因此,高血压肾损害被视为终末期肾病并导致透析需求的重要病因。治疗颇为棘手,研究行之有效的治疗策略是临床上亟需解决的问题。与高血压病相关的。肾损害的涉及肾小球和肾间质的损伤,最终会导致肾功能障碍甚至肾功能衰竭。在高血压病程中持续升高的血压水平导致肾脏血流动力学紊乱和局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统的活化,具有促氧化和促炎的作用,被认为是肾脏损害的启动因素。氧化应激在于高血压病相关的肾脏损害的进展中起着关键性作用。氧化应激反应产生的活性氧几乎影响了肾脏所有的固有细胞和浸润细胞导致肾脏微环境改变。首先,在高血压性肾损害中,肾小球内皮细胞作为滤过膜的第一层屏障,是氧化应激和炎症反应的首当其冲的受害者。其次,氧化应激可以促进足细胞凋亡和节段性肾小球硬化的发生,导致肾脏滤过功能障碍。第三,氧化应激通过促进肾脏中近端小管和系膜细胞的上皮间质转化促进了肌成纤维细胞的在肾脏的积累,导致肾间质细胞外基质的重塑。第四,氧化应激和炎症反应可以引起炎症细胞的趋化和浸润,进一步加重高血压病肾损害。因而抗氧化治疗是高血压性肾损害重要的治疗策略。在氧化应激激活的各种信号通路中,叉头蛋白(Forkbox, Fox)01核转录因子在保护细胞中对抗氧化应激损伤中起到了重要的作用。在正常或病理状态下,FoxO1主要是调节了特异性的抗氧化酶类的表达以保护组织细胞免于氧化损伤。FoxO1也可以抑制系膜细胞的EMT和ECM的分泌。多种转录后调节机制可以直接调控FoxO1蛋白的功能,也可以通过调节肾脏炎症和纤维化信号发挥肾脏保护作用。高血压病肾损伤是高血压病缓慢进展的病程中出现的肾脏并发症,符合中医“久病入络”观点。它是由于致病因素引起了肾络主持营卫气血交互生化的功能障碍,导致肾络气血壅滞,体用俱损,与继发性产生的痰浊瘀毒相互影响,络息成积,致使肾脏发生病理改变。所以,通络干预,恢复“络以通为用”,是切合高血压病肾损伤病机的治法。通心络是基于中医络病学制定的通络干预的代表方剂,具有益气活血、通络止痛的作用。实验证据显示通心络在心肾损伤中具有抗氧化、抗炎、抗纤维化等多效性药理作用。然而,通心络对高血压病肾损害的治疗作用及机制研究尚少。在本实验中,我们假设通心络通过调节氧化应激和FoxO1信号保护高血压病肾损害。为了验证这个假设,我们评估了通心络对SHR肾脏损伤的影响并进一步探讨了其作用机制。研究目的1.观察通心络对SHR高血压病肾损伤在结构和功能的影响；2.探讨通心络对SHR肾脏氧化应激与抗氧化机制的影响；3.探讨通心络对SHR高血压病肾损伤的可能的作用机制,及其与FoxO1信号通路及其转录后调节机制的关系。研究方法1.实验动物的分组自发性高血压大鼠作为原发性高血压的动物模型。将20只8周龄雄性SHR随机分为通心络治疗组,以及阳性对照组,每组各10只。10只8周龄Wistar Kyoto大鼠作为正常对照组。通心络溶于生理盐水配成溶液,通心络治疗组每天分别按每千克体重给予SHR0.38g通心络溶液灌胃。正常对照组(WKY组)和阳性对照组(SHR组)每天给予等量生理盐水灌胃。2.血压的测量采用无创血压计测量大鼠尾动脉压。3.肾功能参数的测量采用ELISA法分析尿蛋白、血清和尿肌酐,并计算尿蛋白排泌率和肌酐清除率。4.组织病理学分析将大鼠肾脏标本制备为石蜡切片,进行肾脏糖原的PSA染色,并计算肾小球硬化指数。应用免疫组织化学染色,观察肾脏组织内a-SMA、desmin、纤连蛋白、胶原Ⅳ和CD68的表达情况。5.氧化应激损伤的标志物的检测。应用硫代巴比妥酸法测量丙二醛。应用紫外光比色法测量蛋白质羰基。可见分光光度法检测NAPDH氧化酶(NOX)的活性6.抗氧化能力的检测。应用羟胺法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性。应用紫外光比色法测量过氧化氢酶活性。7.实时定量逆转录PCR收集各组别的肾脏组织并提取mRNA,进行逆转录和实时定量PCR,检测细胞及组织中NOX亚单位p47和p67 phox、SOD、过氧化氢酶、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平。8.蛋白印迹收集各组别的肾脏组织并提取蛋白,分别检测FoxO1、phospho-FoxO1, ERK1/2 phospho-ERK1/2, P38、phospho-P38、PI3K、phospho-PI3K、Akt、 phospho-Akt、AMPK、phospho-AMPK、SIRT1、TGFβ1、SMAD3、phospho-SMAD3等蛋白的表达水平。9.统计学分析应用SPSS 18.0软件分析处理数据,数据以均数±标准误表示。两组比较采用t检验；组间比较使用单因素方差分析法。以P0.05被认为有统计学意义。研究结果1.通心络降低了SHR的血压。与对照组比较,通心络治疗组的收缩压显著下降。2.通心络减轻了SHR的肾功能损伤。与对照组比较,通心络治疗组的尿蛋白排泌率和肌酐清除率显著下降。3.通心络减轻了SHR肾脏氧化应激损伤。与对照组比较,通心络治疗组的肾脏MDA、蛋白质羰基、NOX活性及亚单位mRNA表达显著减少。4.通心络增加了SHR肾脏抗氧化能力。与对照组比较,通心络治疗组的SOD和过氧化物酶的活性及mRNA表达显著增加。5.通心络促进了SHR肾脏FoxO1的转录后调节和活化。与对照组比较,通心络显著减少了ERK1/2和P38的磷酸化水平,并未显著改变AMPK、P13K和Akt的磷酸化水平和SIRT1的表达。与对照组比较,通心络治疗组的FoxO1的磷酸化水平显著减少。6.通心络改善了SHR的肾脏结构损伤。与对照组比较,通心络治疗组的GSI、足细胞损伤标志物desmin的表达、肾间质纤维化显著减少。与对照组比较,通心络治疗组的促纤维化信号通路蛋白TGF表达和Smad3的磷酸化水平。7.通心络抑制了SHR肾脏的炎症反应与对照组比较,通心络治疗组的肾脏CD68的蛋白表达以及IL-6和TNFa的mRNA表达显著减少。研究结论1.通心络改善了高血压病肾脏结构和功能的损害；2.通心络减轻了高血压病肾脏氧化应激损伤和炎症,改善了肾脏的抗氧化能力；3.通心络促进了高血压病肾脏抗氧化信号FoxO1的转录后调节和活化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R544.1
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本文编号：2059578