MiR-138与SIRT1之间的相互拮抗关系以及这种关系在血管生成中的作用

发布时间：2018-08-23 15:19

【摘要】：目的：通过建立细胞衰老模型来研究内皮细胞在长期培养过程中细胞增殖能力的变化方式以及microRNA-138表达水平的变化方式,并探讨microRNA-138在这一过程中作用。方法：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)连续4周每周以1：3的方式进行传代培养,并将1-4周中每一周的细胞命名为P1、P2、P3和P4。每一代的细胞在固定的时间点(0、24、48和72 h))检测细胞的增殖能力。通过RT-PCR实验检测每一代细胞microRNA-138的表达量。通过β-半乳糖苷酶染色检测microRNA-138对内皮细胞衰老程度的影响。通过CFSE实验以及PI实验检测microRNA-138对内细胞增殖能力的影响并研究具体的影响机制。结果：人脐静脉内皮细胞的增殖能力随着培养时间的延长而逐渐下降。通过RT-PCR实验发现microRNA-138在人脐静脉内皮细胞内稳定表达,其含量随着内皮细胞培养时间的延长而逐渐增加,在P1代细胞中的表达量最低而在P4代细胞中的表达量最高。在细胞衰老实验中可以看到microRNA-138可以显著促进内皮细胞衰老。MicroRNA-138可以明显抑制人脐静脉内皮细胞的增殖。MicroRNA-138可以将G2/M期的细胞从29%降到11.84%,将G1/G0期的细胞从55.99%上升到75.83%。结论：在长期培养的过程中,内皮细胞逐渐衰老,增殖能力逐渐下降,与此同时,microRNA-138的表达水平逐渐上升。MicroRNA-138可以促进细胞衰老并通过改变细胞周期的方式抑制内皮细胞的增殖。目的：之前的研究证实microRNA-138能够抑制血管内皮细胞的增殖。本研究通过各种体内、体外功能实验探讨microRNA-138对血管内皮细胞成血管功能的影响。方法：通过迁移实验、成血管实验、成球实验研究等体外实验研究microRNA-138对血管内皮细胞成血管能力的影响。通过基质胶塞实验以及视网膜成血管实验等体内实验研究microRNA-138能否对体内的成血管过程产生影响。结果：在体外实验中,我们发现microRNA-138能够抑制内皮细胞额迁移能力,减少管腔样结构在基质胶上形成并能够抑制三维内皮细胞球的芽生能力。在基质胶塞实验中,我们看到microRNA-138能够抑制能够拮抗VEGF的诱导成血管作用。在视网膜成血管实验中,microRNA-138能够抑制新生小鼠的视网膜内出生后的血管生成。结论：在体内和体外的成管功能实验中,microRNA-138能够抑制内皮细胞的血管生成能力。目的：之前的研究证实,microRNA-138能够抑制内皮细胞的血管生成能力,但具体的机制并不明了,本部分研究探讨microRNA-138调控血管生成的具体机制。方法：通过生物信息学算法寻找microRNA-138的下游靶基因,通过双荧光素酶实验探讨microRNA-138对下游靶基因的调控方式,通过WB实验以及PCR实验检测在内皮细胞中microRNA-138是否能对靶基因进行调控。通过回复实验验证microRNA-138调控血管生成的过程是通过下游靶基因完成的。结果：SIRT1是microRNA-138的下游靶基因,该基因的nRNA3'UTR区与microRNA-138互补配对,双荧光素酶实验证实microRNA-138可以通过SIRT1 mRNA3’UTR调控SIRT1的表达。在内皮细胞中,过表达microRNA-138能够下调SIRT1mRNA水平以及蛋白水平。过表达SIRT1能够逆转microRNA-138对内皮细胞成血管能力的抑制作用结论：MicroRNA-138通过下调SIRT1的表达调控内皮细胞的血管生成能力
[Abstract]:AIM: To study the changes of cell proliferation and microRNA-138 expression during long-term culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), and to explore the role of microRNA-138 in this process. Cells were cultured for 1-4 weeks and named P1, P2, P3 and P4. Cell proliferation was measured at fixed time points (0, 24, 48 and 72 h). The expression of microRNA-138 was detected by RT-PCR. The effect of microRNA-138 on endothelial cell senescence was detected by beta-galactosidase staining. The effects of microRNA-138 on the proliferation of human umbilical vein endothelial cells were investigated by CFSE and PI assays. Results: The proliferation ability of human umbilical vein endothelial cells decreased with the prolongation of culture time. MicroRNA-138 can significantly promote endothelial cell senescence. MicroRNA-138 can significantly inhibit the proliferation of human umbilical vein endothelial cells. MicroRNA-138 can inhibit the G2/M phase. CONCLUSION: Endothelial cells gradually senesce and proliferative capacity gradually decrease during long-term culture, while the expression of microRNA-138 gradually increases. MicroRNA-138 can promote cell senescence and inhibit endothelial fineness by changing cell cycle. Objective: Previous studies have confirmed that microRNA-138 can inhibit the proliferation of vascular endothelial cells. In this study, we investigated the effects of microRNA-138 on vascular endothelial cells in vitro and in vivo. Methods: Migration experiments, angiogenesis experiments, globulation experiments and other in vitro experiments were used to study microRNA-13. The effect of microRNA-138 on vascular endothelial cells was studied by matrix gel plug test and retinal angiogenesis test in vivo. Results: In vitro experiments, we found that microRNA-138 could inhibit the frontal migration of endothelial cells and reduce the lumen-like structure in the base. MicroRNA-138 can inhibit angiogenesis in vivo and in vivo. Conclusion: In vivo and in vivo, microRNA-138 can inhibit angiogenesis in neonatal mice. Objective: Previous studies have confirmed that microRNA-138 can inhibit the angiogenesis of endothelial cells, but the specific mechanism is not clear. This part studies the specific mechanism of microRNA-138 in regulating angiogenesis. Informatics algorithm searches for the downstream target gene of microRNA-138. The regulation of microRNA-138 on the downstream target gene was studied by double luciferase assay. Whether microRNA-138 can regulate the target gene in endothelial cells was detected by WB assay and PCR assay. Results: SIRT1 was the downstream target gene of microRNA-138. The nRNA3'UTR region of SIRT1 was complementary to microRNA-138. Double luciferase assay confirmed that microRNA-138 could regulate SIRT1 expression through SIRT1 mRNA 3'UTR. Overexpression of microRNA-138 could down-regulate SIRT1 mRNA level and protein water in endothelial cells. Ping. Overexpression of SIRT1 can reverse the inhibitory effect of microRNA-138 on the angiogenesis of endothelial cells. Conclusion: MicroRNA-138 regulates the angiogenesis of endothelial cells by down-regulating the expression of SIRT1.
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543

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本文编号：2199464