细胞自噬对oxLDL诱导巨噬细胞焦亡（pyroptosis）的影响及机制

  背景及目的：细胞焦亡是近期发现的一种新的细胞死亡方式，其生物学特征是依赖于半胱天冬氨酸蛋白酶-1（Cysteine aspartate-specific protease-1, caspase-1）的死亡方式并伴随着炎症反应的发生。最近的研究发现介导细胞焦亡的重要功能分子caspase-1与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。Caspase-1的重要功能之一是介导单核巨噬细胞等受到病原体感染或内源性因素刺激后引起的细胞焦亡；同时，把白细胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）前体裂解成具有活性的IL-1β，而后者等能募集、激活其他免疫细胞，诱导其它炎症因子、趋化因子、粘附分子等的合成，它们级联放大了炎症反应，促进动脉粥样硬化的发展。自噬是真核细胞所共有的一种降解胞内异常或过多的细胞器、蛋白等来维持细胞正常功能的机制。自噬可利用其双层的膜结构将要降解的细胞器或蛋白等进行包裹，形成自噬体，自噬体随后与溶酶体融合，将这些底物进行降解。缺乏自噬会导致胆固醇晶体在斑块中的聚集以及NACHT决定域，亮氨酸重复序列，pyrin决定域蛋白-3（NOD-,LRR-,and pyrin domain[PYD]-containingprotein3, NLRP3）炎症小体的活化，从而加重了动脉粥样硬化的发展进程。活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）的产生与细胞焦亡关系密切，可以活化caspase-1，引起细胞焦亡。自噬在炎症体及caspase-1的活化中发挥重要作用。他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，此类药物表现出多效性，包括改善内皮功能，促进斑块的稳定，减少氧化应激和炎症，抑制血栓的形成。最近研究发现他汀类药物可以提高某些组织细胞的自噬水平。但其对氧化的低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, oxLDL）诱导的巨噬细胞自噬、细胞焦亡的影响以及产生影响的可能途径及相关机制目前尚不清楚。本研究拟通过建立oxLDL诱导巨噬细胞脂质聚集的模型，观察脂质聚集的巨噬细胞在辛伐他汀作用后细胞自噬及焦亡发生情况及可能的作用机制，探讨他汀类药物在oxLDL诱导巨噬细胞脂质聚集过程中的作用，为寻找药物作用新途径及提供新的临床治疗思路提供实验依据。方法：oxLDL作用于J774A.1小鼠巨噬细胞，采用油红O染色法检测细胞内的脂质聚集情况；细胞焦亡的检测采用乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase, LDH）释放试剂盒检测LDH的释放；荧光显微镜观察丫啶橙（Acridine orange,AO）、溴化乙锭（Ethidium Bromide, EB)的染色情况；Western-blot检测pro-caspase-1、cleaved caspase-1和IL-1β的表达情况；加入辛伐他汀药物作用后，检测上述实验结果的变化情况；采用2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（2’,7’-dichlorofluorescindiacetate, DCFH-DA）染色流式细胞仪检测辛伐他汀作用前后细胞内ROS的水平；采用western-blot检测辛伐他汀作用前后LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin-1的表达情况；激光共聚焦观察LC3-GFP荧光聚集情况。结果：成功构建了oxLDL诱导脂质聚集的巨噬细胞的模型；油红O染色结果表明，oxLDL作用于巨噬细胞后可导致脂质聚集，，并呈明显的剂量依赖；OxLDL作用于巨噬细胞后，LDH的释放显著增加由（18.04±3.57）%增加到（62.4±7.32）%；AO EB的复染中，橘红色的荧光所占百分比显著增加由（6±4）%增加到（65±3）%，提示细胞膜出现不完整的情况增多；Western-blot检测caspase-1和IL-1β的表达呈增高的趋势；加入辛伐他汀药物作用后，油红O染色结果表明脂质聚集情况减少，总胆固醇检测显示细胞内总胆固醇有减少的趋势，细胞焦亡检测结果：LDH释放减少，AO EB染色结果显示橘红色的荧光有所占百分比减少趋势，EB染色阳性（橘红色）细胞减少至（35±7）%，western-blot检测活化caspase-1和成熟IL-1β的表达明显降低。细胞自噬检测结果：Western-blot结果显示细胞内LC3Ⅱ/Ⅰ的表达与单一加入oxLDL作用的巨噬细胞相比增加明显；激光共聚焦显微镜结果也表明辛伐他汀可显著增加GFP-LC3荧光聚集体的形成。DCFH-DA染色流式细胞仪检测结果：oxLDL诱导巨噬细胞产生大量的ROS，在辛伐他汀作用后，细胞内ROS水平显著降低至（139±0.97）%，应用3-MA自噬抑制剂，巨噬细胞内的ROS恢复至较高水平，同时对辛伐他汀抑制的oxLDL诱导细胞焦亡水平也有进一步提高。结论：在oxLDL诱导的巨噬细胞脂质聚集过程中，巨噬细胞发生caspase-1介导的细胞焦亡，伴随炎症细胞因子IL-1β的分泌；辛伐他汀可能通过增加巨噬细胞自噬、降低细胞内ROS的水平，抑制oxLDL诱导的巨噬细胞焦亡。