【摘要】：Nav1.5蛋白质是形成心肌电压门控的钠通道复合体孔径最主要的α亚基,所产生的钠电流在心脏动作电位的产生以及传导过程中起到非常关键的作用。Nav1.5蛋白在体内存在于多蛋白复合体中,并通过与actin细胞骨架以及细胞外基质相互作用为钠通道复合体、心肌结构以及电功能提供重要的功能桥梁作用。编码Nav1.5的SCN5A基因突变能够导致一系列遗传性心律失常疾病的产生,包括心房颤动、Brugada综合征、长QT综合征、进行性心脏传导阻滞、病态窦房结综合征以及扩张性心肌病。目前已经发现许多蛋白质能够结合Nav1.5。我们实验室曾经报导过一个在核质蛋白运输中起重要作用的小分子蛋白MOG1,能够与Na,1.5直接相互作用并促进Nav1.5转运至细胞膜,进而增大钠通道电流密度。进一步研究发现,MOG1促进Nav1.5从内质网运出并转运至细胞膜上的小窝处。其他与Nav1.5存在相互作用的蛋白质还包括4个p亚基、成纤维细胞生长因子同源因子1B、类似Nedd4的泛素化连接酶(Nedd4-2)、锚蛋白G、酪氨酸激酶Fyn、syntrophin、蛋白酪氨酸磷酸酶PTPH1以及14-3-3η等。大多数这些蛋白质不仅仅结合Nav1.5还能影响其生理性质。在心肌细胞中MOG1、锚蛋白G以及14-3-3η能够调控Nav1.5在细胞膜上的定位.Nedd4-2通过与Nav1.5相互作用并调控Nav1.5的降解。然而Nav1.5蛋白复合体是高度复杂的,许多成员还待发现。基于此,该项目主要目标是发现其他新的Nav1.5蛋白复合体组分。在本研究中,通过酵母双杂技术以及后续的一系列生化与分子生物学分析,我们确定aB-crystallin蛋白质为Nav1.5新的相互作用蛋白。GST-pull down以及免疫共沉淀实验验证了aB-crystallin与Nav1.5的确存在相互作用。全细胞膜片钳结果显示高表达aB-crystallin能够显著地增大钠通道电流密度,导致电流密度增大的分子机制是由于细胞膜上Nav1.5的表达增加。aB-crystallin通过减弱细胞膜上Nav1.5蛋白内陷以及Nav1.5蛋白泛素化,导致细胞膜上Nav1.5的表达增加。敲低aB-crystallin蛋白的表达能够显著地降低Nav1.5蛋白在细胞膜上的表达。以前的研究报导Nav1.5蛋白泛素化通过泛素化连接酶Nedd4-2结合到Nav1.5蛋白质C末端上的PY基序上介导完成。泛素化连接酶Nedd4-2能够增加Nav1.5的泛素化以及减少钠通道电流密度。考虑到αB-crystallin同样能够降低Nav1.5泛素化,因此检测了αB-crystallin能否与Nedd4-2之间存在相互作用。免疫共沉淀结果分析显示,αB-crystallin能够与Nedd4-2相互作用,然而当Nedd4-2蛋白催化活性位点突变后(Nedd4-2-CS),减弱了与αB-crystallin之间的相互作用。同时在Nedd4-2-CS存在下,αB-crystallin丧失了增大钠通道电流密度的功能。当Nav1.5蛋白突变为N2vv1.5-V1980A后,降低了Nedd4-2与Nav1.5蛋白的相互作用,减少了Nav1.5蛋白泛素化,同样使αB-crystallin丧失了增大钠通道电流密度的功能。小分子热休克蛋白αB-crystallin由CRYAB基因编码,在许多组织中有广泛表达,包括心脏、晶状体以及骨骼肌。目前已经发现CRYAB基因突变能够导致多种遗传疾病的发生,包括白内障、骨骼肌肌病以及心肌病等。我们发现,其中2个αB-crystallin蛋白R109H以及R151X突变位点丧失了能够增大钠通道电流密度的功能。由于钠通道电流密度减小与Brugada综合征、进行性心脏传导阻滞,病态窦房结综合征以及房颤等疾病有关,携带αB-crystallin蛋白R109H或者R151X突变位点的患者应该注意可能伴发患有这些心律失常疾病的潜在风险。本研究发现αB-crystallin是一个新的Nav1.5相互作用蛋白。αB-crystallin与Nav1.5蛋白相互作用,能够通过改变细胞膜上Nav1.5蛋白的表达、内陷以及Nav1.5蛋白的泛素化进而增大记录的钠通道电流密度,这些需要αB-crystallin与Nav1.5以及αB-crystallin与功能性Nedd4-2蛋白之间的相互作用。考虑到钠通道Nav1.5在心脏生理功能、心律失常以及猝死方面起到非常重要的作用,以及本研究发现αB-crystallin在调控N钆1.5功能中起到非常重要的作用,我们推测αB-crystallin在心脏生理功能、心律失常以及猝死方面也会起到同样重要的作用。本研究同样有助于为我们提供新的治疗策略,为治疗因钠通道Nav1.5功能减弱引起的致命性心律失常疾病提供感兴趣的潜在靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R541.7
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本文编号：2255023
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