【摘要】：1研究背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是心血管疾病和卒中的主要病因。既往研究显示动脉粥样硬化易损斑块血栓形成及斑块破裂可导致心肌梗死、卒中和猝死。因此,斑块易损性已成为国内外冠状动脉粥样硬化性心脏病的研究热点。炎症是目前公认的一个参与动脉粥样硬化发生、发展,动脉斑块破裂和血栓形成的重要因素。其中,巨噬细胞是关键的炎症细胞,参与动脉粥样硬化的每一个阶段,从斑块形成,斑块破裂到血栓形成,并广泛存在于动脉粥样硬化斑块中。巨噬细胞分泌的生长因子及多种炎症因子,如白细胞介素6(Interleukin-6, IL-6),白细胞介素8 (Interleukin-8, IL-8),单核细胞趋化因子-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1),肿瘤坏死因子α (Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)等。在这些炎症因子的作用下,更多的单核细胞浸入内皮下,加剧炎症反应并形成动脉粥样硬化进展期斑块。此外,巨噬细胞对斑块形态大小、坏死核心形成及“薄”纤维帽等易损斑块特征性改变亦至关重要。因此,探究影响巨噬细胞炎症反应的调节因子是防治动脉粥样硬化性疾病的关键。近年研究发现,脂肪组织不仅是机体的能量贮存器官,更具有重要的内分泌功能。脂肪细胞可分泌多种细胞因子,包含脂联素(Adiponectin, APN)、抗素(Resisting C1q肿瘤坏死因子相关蛋白(C1q/Tumor necrosis factor related proteins, CTRPs)等。其中,Clq肿瘤坏死因子相关蛋白9(C1q/Tumor necrosis factor related protein 9, CTRP9)是一种新型脂肪细胞因子,属于肿瘤坏死因子相关蛋白家族(CTRP)成员之一,且与APN高度同源。既往文献报道,APN具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗凋亡、抗糖尿病等多种生物学功能,且与动脉粥样硬化斑块易损性密切相关。最新研究显示脂肪细胞因子CTRP9亦与心血管疾病密切相关。研究证实CTRP9可显著降低血管平滑肌细胞的增殖和新生内膜形成,并可诱导血管舒张。另据临床研究显示,血清CTRP9水平与2型糖尿病患者血糖利用及动脉僵硬度相关。本课题组前期研究显示,血清CTRP9与急性冠脉综合征显著负相关。以上信息均提示CTRP9可能参与动脉粥样硬化斑块的形成及发展。然而,CTRP9对动脉粥样硬化斑块炎症反应及斑块稳定性的作用研究尚未见报道。终上所述,这些科学问题即构成本课题的研究目的及设计思路。2研究目的(1)探讨脂肪细胞因子CTRP9对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的斑块稳定性的影响；(2)阐明CTRP9促进斑块稳定性作用的新靶点。3实验方法3.1动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠动物模型构建8周龄雄性ApoE-/-小鼠,全程高脂喂养(0.25%胆固醇和15%黄油),行右侧颈总动脉套管(内径0.33mm,外径0.50mm,长度2mm)置入术,促进颈动脉斑块形成。套管术后8周,随机分为3组：LV-CTRP9实验组：颈静脉注射携带CTRP9基因的慢病毒,病毒总量为2×107 TU/只,体积为100μL；LV-eGFP阴性病毒对照组：颈静脉注射携带GFP基因的慢病毒,病毒总量为2×107 TU/只,体积为100μL；Vehicle空白对照组：颈静脉注射等体积PBS稀释液,体积为100μL。颈静脉注射4周后,给予小鼠安乐死。3.2血糖,血脂检测动物处死前,空腹采血,收集血清,检测血糖(GLU),游离脂肪酸(NEFA),甘油三酯(TG),总胆固醇(TC),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。3.3易损指数慢病毒转染30天后取材。取小鼠右侧颈动脉制成冰冻标本,5μm厚冰冻切片行特殊染色(HE染色、油红O染色、天狼猩红染色)；免疫组化染色方法检测斑块内MOMA-2, α-SMA蛋白表达情况。Image-Pro Plus 5.0图像分析软件计算阳性面积占动脉粥样硬化斑块面积百分比。根据公式计算易损指数。易损指数=(巨噬细胞相对含量+脂质相对含量)／(平滑肌相对含量+胶原相对含量)。3.4免疫组化免疫组化方法检测斑块局部炎症因子表达：如TNF-α, MCP-1。Image-Pro Plus5.0图像分析软件计算阳性面积占动脉粥样硬化斑块面积百分比。3.5细胞培养及慢病毒转染培养RAW264.7小鼠巨噬细胞(培养基为DMEM+10%FBS,温度37℃,气体条件5%CO2)。分别用携带CTRP9基因的慢病毒与携带GFP对照基因的慢病毒转染RAW264.7小鼠巨噬细胞；72小时后荧光显微镜观察转染效率。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理转染后细胞,继续培养24h,检测巨噬细胞炎症因子表达变化。3.6 Western Blot收集细胞及培养基,并提取蛋白。应用Western Blot技术检测转染后巨噬细胞CTRP9蛋白表达水平及巨噬细胞炎症因子TNF-α和MCP-1蛋白表达水平。应用Image J软件分析。3.7统计分析所有数据采用均数士标准误(mean±SEM.)表示,两两比较采用非配对t检验,多组间比较采用方差分析(ANOVA)。所有数据采用SPSS 13.0统计学软件分析,p0.05,有统计学差异。4结果4.1动物实验4.1.1 LV-CTRP9实验组小鼠血清CTRP9蛋白表达升高与LV-eGFP阴性对照组比较,LV-CTRP9实验组小鼠血清CTRP9水平升高3.9倍(p0.05);与Vehicle空白对照组比较,LV-CTRP9实验组小鼠血清CTRP9水平升高3.5倍(p0.05),而两对照组间无显著差异(p0.05)。4.1.2 LV-CTRP9实验组小鼠血糖、血脂水平影响LV-CTRP9实验组小鼠与LV-eGFP阴性病毒对照组小鼠比较,血清血糖水平下降(p0.05)；LV-CTRP9实验组小鼠与Vehicle空白对照组小鼠比较,血清血糖水平下降(p0.05),而两对照组间比较无显著差异(p0.05)。LV-CTRP9实验组小鼠与两对照组小鼠比较,血脂水平未见显著差异(p0.05)。4.1.3 CTRP9可增强动脉粥样硬化斑块稳定性LV-CTRP9实验组小鼠与两对照组小鼠比较,脂质及巨噬细胞含量降低(p0.05),平滑肌及胶原含量增加(p0.05),斑块易损指数下降(p0.05)；两对照组间比较无显著差异(p0.05)。4.1.4 CTRP9可减少斑块局部炎症因子表达LV-CTRP9实验组小鼠与两对照组小鼠比较,斑块局部炎症因子TNF-α和MCP-1蛋白表达下降(p0.05)；两对照组间比较无显著差异(p0.05)4.2细胞实验4.2.1 LV-CTRP9实验组巨噬细胞及培养基中有CTRP9蛋白表达慢病毒转染小鼠巨噬细胞,当MOI=60时,转染效率近90%。与两对照组比较,LV-CTRP9实验组小鼠巨噬细胞裂解液和细胞培养基中均可检测到CTRP9蛋白。4.2.2 LV-CTRP9实验组巨噬细胞炎症因子表达降低与LV-eGFP组比较,LV-CTRP9实验组RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症因子TNF-a和MCP-1表达降低(p0.05)。5结论(1)提高血清CTRP9蛋白水平可显著降低斑块局部脂质和巨噬细胞含量,增加胶原和平滑肌细胞含量,从而降低斑块易损性；(2)体内试验证实CTRP9可通过降低斑块局部炎症因子TNF-a和MCP-1的表达,发挥抗炎,稳定斑块作用；(3)体外实验进一步证实CTRP9可能通过减少巨噬细胞表达TNF-a和MCP-1,进而降低炎性细胞浸润,发挥抗炎,稳定斑块作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5
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