冠脉不稳定斑块生物标志物及其调节机制的研究

发布时间：2018-10-13 12:32

【摘要】：背景：急性冠脉事件发病凶险,严重威胁人们的生命。研究表明,约75%的急性冠脉事件是由不稳定斑块破裂引起的,因此发展早期识别此类危险斑块的检查方法,探讨影响斑块稳定性的调节机制,对急性心血管事件的防治具有重要意义。目前临床上对不稳定斑块的识别主要是高分辨影像技术,但其价格昂贵,不利于早期筛查；而循环血标志物的检查经济便捷,因而研究发现有效的不稳定斑块标志物成为当前的关注热点。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类具有锌离子依赖性,降解胶原等细胞外基质(ECM)成分的内肽酶,不仅参与胚胎形成、血管新生和伤口愈合等生理过程,而且与组织重构、肿瘤转移、动脉粥样硬化的发生发展等病理进程密切相关。课题组前期研究发现冠脉非钙化斑块患者的血清MMP-9水平显著高于钙化斑块及无斑块人群者,本研究拟在此基础上扩大样本量,进一步确定MMP-9和MMP-2识别非钙化斑块的能力,同时以连续入选病例的方式模拟自然人群特征,利于将MMP-9和MMP-2对非钙化斑块人群早期筛查推广应用于临床。在动脉粥样硬化疾病进程中,MMPs通过降解斑块内基质成分,进而使纤维帽变薄,最终导致斑块破裂,因此探寻MMPs的调节分子及调控机制,可为稳定斑块纤维帽、防止斑块破裂提供新的干预靶点。溶血磷脂酸(LPA)是一种内源性的生物活性磷脂信号分子,通过6种不同的G蛋白偶联受体(LPA1～LPA6)发挥不同的生物学功能。研究表明,LPA可诱导人卵巢癌,人脑胶质瘤等肿瘤细胞表达分泌MMPs参与侵袭过程,但是在动脉粥样硬化进程中,LPA在调节MMPs表达分泌的环节中扮演什么角色尚不清楚,LPA受体又能否成为稳定纤维帽、防止斑块破裂的干预靶点,这些问题均是本课题研究的重点。目的：①研究MMP-9和MMP-2作为血清标志物识别非钙化斑块的可行性,为斑块破裂诱发的心血管事件提供新的预防途径和诊断工具,同时初步探索新型的斑块不稳定性相关的炎症标志物；②研究LPA对MMP-9的表达分泌的影响极其信号调节机制,探索LPA信号与斑块纤维帽的相关性,探讨LPA受体或可成为稳定斑块纤维帽、防止斑块破裂的新的干预靶点。方法：连续选取2012年7月-2014年2月在我院就诊并进行64排螺旋CT检查的门诊患者862例,联合急性冠脉综合征的典型临床症状入组正常对照组474例、钙化斑块组159例、非钙化斑块组80例和混合斑块组149例,采用ELISA方法检测MMP-9和MMP-2的血清含量,分析其对非钙化斑块的诊断能力。从上述每组受试者中再随机选取15例,进行TNF-a、Eotaxin、PTX3 (pentraxin 3)、MPO (myeloperoxidase)等炎症因子血清含量的测定,初步探索其作为斑块不稳定性的新型标志物的可行性。利用免疫组织化学和免疫荧光技术检测LPA生成酶ATX(autotaxin)和MMP-9在不同程度的人冠脉斑块组织中的共定位情况,分别利用RT-PCR、Western Blot、ELISA和明胶酶谱实验检测LPA对MMP-9的表达、分泌水平和活性的影响。以相应抑制剂处理细胞,采用荧光素酶报告基因分析,siRNA和miRNA转染等技术阐明LPA通过多条信号通路调节MMP-9的机制。用SPSS17.0进行分析,P0.05为差异有统计学意义。结果：研究显示血清MMP-9水平在非钙化斑块组明显高于正常对照组、钙化斑块组和混合斑块组(731.0±271.2 ng/mL vs 533.7±243.8 ng/mL,593.0±276.6 ng/mL,588.2±246.7 ng/mL, p0.001),其单独识别非钙化斑块的ROC曲线下面积为0.70,且联合其它指标后识别能力未有增加。进一步分析发现,利用血清HDL-C水平分层后有助于MMP-9诊断价值的提高,在HDL-C≥1.55 mmol/L的患者中,血清MMP-9识别非钙化斑块的效能明显增加,ROC曲线下面积为0.84。此外,本研究发现MMP-9联合MMP-2和年龄因素诊断斑块存在的ROC曲线下面积为0.72,HDL-C≥1.55 mmol/L的患者中,联合诊断斑块存在的曲线下面积增加至0.80。但在动脉粥样硬化不稳定斑块相关的四种候选炎症因子中,未能发现在正常对照组、钙化斑块组、非钙化斑块和混合斑块组有差异表达的因子。基于以上MMP-9与斑块稳定性的密切关系,本研究后续对MMP-9的调节机制进行实验研究。人群研究表明急性冠脉综合征患者LPA和MMP-9的外周血水平显著高于正常人,并且二者具有相关性。同时研究发现在人冠脉斑块组织中,LPA的生成酶ATX和MMP-9的含量随斑块不稳定性的增加而升高,且二者存在共定位现象,提示LPA与MMP-9之间可能存在调节关系。在THP-1源性巨噬细胞中研究发现,LPA对MMP-9的表达、分泌和活化的促进作用呈剂量和时间依赖性,LPA 10μM处理24 h时促进MMP-9的表达和分泌最为明显,以此作为后续实验的基础条件。利用放线菌素D和放线菌酮预处理细胞,分别抑制MMP-9 mRNA的新生和蛋白质的合成,结果显示LPA对MMP-9表达的促进作用均受到抑制,表明LPA对MMP-9的上调作用发生在其mRNA的从头合成阶段,即转录水平。结合文献报道筛选出三个可能介导LPA调节MMP-9的转录因子：PPARγ、NF-κB和AP-1,分别采用相应抑制剂GW9662、PDTC和Tan ⅡA处理细胞,发现仅NF-κB介导了LPA促进MMP-9表达的作用。利用U0126阻断ERK1/2后,LPA上调MMP-9表达的效应减弱,同样抑制了LPA诱导NF-KB活性的升高,表明LPA通过ERK1/2信号通路促进转录因子NF-κB的活性,从而上调MMP-9的表达。此外研究结果显示,LPA可上调miR-21和miR-221的表达,miRNAs inhibitor转染实验表明miR-21参与巨噬细胞LPA上调MMP-9的表达。最后利用RNAi技术分别阻断THP-1源性巨噬细胞主要表达的LPA1、LPA2和LPA6三种受体后发现,敲低LPA2削弱LPA对MMP-9的促进作用,揭示LPA2介导了LPA调节MMP-9的过程。结论：在高密度脂蛋白胆固醇偏高的人群中,MMP-9对非钙化斑块有较高的诊断效能,或可成为斑块不稳定性的生物标志物,有望应用于不稳定斑块的早期筛查,成为临床常规检测的一种诊断方法。LPA能够诱导人巨噬细胞MMP-9的表达,促进其分泌及活化。LPA通过ERK1/2信号通路促进转录因子NF-κB的活性,以及诱导miR-21的表达,从而上调MMP-9的转录。本研究揭示了LPA可能通过调节MMP-9进而参与动脉粥样硬化斑块稳定性调节的新机制,LPA2受体亚型或可成为防止斑块破裂和急性心血管事件发生的新的干预靶点。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.4

【共引文献】