miR-224对主动脉管壁力学性质的影响及其在夹层发生中的机制研究

发布时间：2018-10-15 13:45

【摘要】：研究目的主动脉夹层(aortic dissection,AD)是严重威胁人类生命健康的一类心血管系统疾病,因其发病具有急、险、重的特点,发病率呈现逐年上升趋势,受到了国内外研究者的重视,因此迫切需要对疾病更深入的研究和认识,然而其发病机制尚未完全阐明。本课题拟通过临床样本分析及动物实验研究,以血管micro RNA-224的异常表达与主动脉管壁的生物力学性质为着眼点,深入探讨主动脉夹层发生发展的机制和干预策略,从基因与生物力学的层面为研究主动脉夹层的发生发展和转归提供科学性的理论依据。同时,本研究将可能为主动脉夹层的早期诊断、预防和治疗提供新的靶标和策略。研究方法通过生物信息学检索发现mi R-224对多种主动脉管壁力学相关基因、蛋白具有调控作用,筛选并确定以mi R-224为研究靶标并进一步验证其与主动脉管壁生物力学性质变化的关系。首先,在符合伦理学审查及患者知情同意前提下,采集正常捐献者主动脉组织6例,胸主动脉夹层患者主动脉6例;对所有主动脉组织样本按照标准流程提取总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测样本中mi R-224表达含量;而后将主动脉组织精细切割成长约15mm的哑铃状式样,进行单轴力学拉伸测试,获得应力应变曲线,极限应力,极限应变等力学指标,并比较mi R-224表达含量与主动脉管壁力学性质变化的关系;为进一步验证干预mi R-224表达后主动脉管壁生物力学性质的变化情况,采用饮食中添加β-氨基丙腈及皮下植入血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)微泵的FVB小鼠建立主动脉夹层模型,通过尾静脉注射mi R-224Agomir/antagomir 15OD/只,分别设立空白对照组、普通造模组、mi R-224上调表达组、mi R-224上调对照组、mi R-224下调表达组、mi R-224下调对照组,研究mi R-224对血管重构和主动脉管壁生物力学性质的影响;实验结束处死小鼠,解剖分离小鼠主动脉,并在大体解剖层面观察统计主动脉夹层病变发生情况,将小鼠主动脉分为4段,4%多聚甲醛固定石蜡包埋切片,HE染色测量小鼠主动脉管壁厚度(Aortic wall thickness);EVG染色比较小鼠主动脉弹力纤维变化,Masson染色检测小鼠主动脉胶原纤维变化;通过q RT-PCR检测验证干预mi R-224后表达含量;免疫组织化学方法检测力学相关蛋白Rho、ROCK1、SMAD表达变化;采用Electroforce 5500动态力学试验机对小鼠主动脉管壁进行单轴拉伸力学测试,记录并比较应力(Stress)、应变(Strain)、极限应力(Failure Stress)、极限应变(Failure Strain)、获得应力应变曲线(stress-strain curve)计算弹性模量(Elastic modulus)及刚度(Stiffness)等力学参数,通过线性拟合分析不同应变条件下对应弹性模量的变化情况,计算应力-应变曲线下面积(AUC),研究并明确干预mi R-224对主动脉管壁力学性质变化的影响。结果临床样本研究,我们通过RT-PCR技术在胸主动脉夹层患者(n=6)与遗体捐献者(正常人)(n=6)样本上进行差异表达检测发现mi R-224在主动脉夹层患者表达呈现显著上调特征(P0.05),分别对主动脉夹层患者及正常捐献者主动脉进行单轴拉伸力学测试,结果表明,夹层组较正常组极限荷载,极限位移,极限应力、极限应变明显降低,差异均具有统计学意义(P0.05)初始弹性模量(Initial elastic module)夹层组较正常组显著降低(P0.01),极限弹性模量(Maxl elastic module)两组间无明显差异(P0.05);动物实验结果显示:造模后主动脉夹层发生率分别为,空白对照组(n=0/11,0)、普通造模组(5/12,41.67%)、mi R-224下调组(3/12,25%)、mi R-224下调对照组(4/12,33.32%)、mi R-224上调组(6/11,54.54%)、mi R-224上调对照组(5/11,45.45%),经统计分析,mi R-224上调组小鼠主动脉夹层发生率较普通造模组显著增高(6/11 vs 5/12,P0.01)mi R-224下调组小鼠主动脉夹层发生率较普通造模组显著降低(3/12 vs 5/12,P0.01);通过q RT-PCR验证表明mir-224agomir可显著促进小鼠主动脉mi R-224的表达mir-224 antagomir可显著抑制小鼠主动脉mi R-224的表达(P0.05);对小鼠主动脉管壁进行力学测试结果显示:较空白对照组,主动脉夹层造模组、mi R-224上调、mi R-224上调对照组、mi R-224下调组、mi R-224下调对照组主动脉管壁厚度明显增厚(P0.05),上调组较下调组管壁平均厚度显著增加(P0.05),mi R-224低表达较mi R-224高表达能够提高主动脉管壁的极限荷载、极限应力、初始弹性模量、极限弹性模量,应力-应变曲线下面积(AUC)平均值,但是极限位移、拉伸比管壁平均周长两组间无明显差异(P0.05);EVG染色分析提示上调mi R-224较对照组使小鼠主动脉弹力纤维减少,结构紊乱,甚至断裂,Masson染色分析表明mi R-224下调可增加小鼠主动脉弹力纤维及胶原纤维含量,这表明下调mi R-224在夹层发生中具有保护性作用,而免疫组化结果提示小鼠主动脉组织中mi R-224上调组较对照组其力学相关Rho、ROCK1、SMAD等信号表达明显增强(P0.05)。结论我们首次探讨了mi R-224在主动脉夹层中表达的差异性同管壁生物力学性质之间的联系,明确了其与夹层发生中的关系,并在此基础上通过动态力学测试仪进行了人主动脉样本生物力学性质的检测,RT-PCR验证得出mi R-224在主动脉夹层患者中呈高表达,同时我们测得人主动脉夹层患者的管壁力学各项指标如管壁厚度、初始弹性模量、极限应力、极限应变等较正常组织捐献者明显降低,提示mi R-224高表达及主动脉管壁力学性质的差异与主动脉夹层形成关系密切。进一步的动物实验结果表明,干预上调mi R-224基因表达后小鼠主动脉夹层的发生率明显增高,而下调mi R-224表达后夹层发生率明显降低,并且提示mi R-224为主动脉夹层发生的促进因素,高表达的mi R-224可以显著降低主动脉管壁极限应力、极限应变,初始弹性模量、应力应变曲线下面积等生物力学指标,促使管壁弹力纤维、胶原纤维含量减低,免疫组化结果提示其可能通过Rho\ROCK1、SMAD等信号通路发挥作用,从而进一步导致主动脉夹层的发展。本研究将为主动脉夹层的早期诊断、预防和治疗提供新的靶标和研究方向。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.1

【参考文献】