【摘要】：胸主动脉瘤是心脏外科十分凶险的大血管疾病,具体潜伏性强,预后差,术后并发症多等特点。近年来,胸主动脉瘤的发病率成逐年递增趋势。目前研究表明,诸多因素参与了胸主动脉瘤的发生,如吸烟,高血压,年龄、家族遗传史、动脉粥样硬化等。胸主动脉瘤在发病早期无特异性症状,仅在瘤体持续扩大压迫周围器官或组织时,表现出如呛咳,呼吸困难,吞咽困难等非特异性症状。胸主动脉瘤的治疗手段较为单一,以主动脉置换术或血管腔内支架植入术为主,但手术难度较大,手术并发症多,预后较差。因此,探索胸主动脉瘤的发生发展的分子机制,并以此作为治疗靶点将为主动脉瘤前期治疗提供新的依据。主动脉血管壁分为内膜、中膜、外膜三层,其中中膜是主动脉壁最重要的部分。主动脉壁中膜主要由血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell , VSMC)、胶原蛋白(Collagen)、弹力纤维(Elastin),及多种细胞外基质成分,炎性因子等构成,上述成分发生病理变化时,均可能导致血管壁收缩功能及强度下降,在主动脉高速高压血流冲击下,出现血管壁扩张等变化,最终导致胸主动脉瘤的发生。目前研究较多的分子机制包括;1、VSMCs由收缩型向分泌型转化,从而影响其原有的收缩功能,影响血管壁强度;2、血管壁中胶原及弹力纤维组成成分及分布异常,导致血管壁脆性升高,弹性下降;3、外界因素刺激下,VSMCs或炎性细胞等分泌和激活基质金属蛋白酶2、9 (matrixmetalloproteinase2/9,MMP2/9)等,破坏胶原等,导致血管壁成分破坏;4、TGFβ/SMAD通路异常近年来被认为是主动脉瘤发生的重要因素。任何因素参与或影响了上述过程均可能导致了主动脉瘤的发生发展。miRNA是一类在真核生物中发现的内源性的具有调控功能的非编码RNA,长度约为20-25个核苷酸,其主要作用机制包括:与mRNA上相关碱基结合,抑制mRNA转录后翻译;通过CAP或Poly (A)依赖的途径抑制mRNA的翻译;影响mRNA脱腺苷化。前体miRNA在Exprotin-5复合物的作用下转运出胞核,在胞浆中有Dicer剪切成为成熟miRNA,并进一步形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC),与 mRNA 的 3'-UTR 区域结合发挥作用,当miRNA与相关靶点完全互补时,甚至可以引起mRNA的降解。目前亦有研究表明,miRNA影响基因启动子的CpG岛甲基化作用,在转录水平直接对靶基因进行调控作用。诸多研究表明miRNA可能参与了主动脉瘤的发生发展。Kim等研究表明miR-712能够靶向抑制TIMP3及RECK表达,进而在体内体外实验中打破基质金属蛋白酶及其抑制剂的平衡,促进主动脉瘤模型小鼠血管壁的扩张。Cheng及Cordes等研究表明抑制miR-143/145能够显著一直SMC中α-SMA,Calponin及SM-MHC的表达,进而参与了主动脉瘤的发生发展。亦有研究表明,在SMC中过表达miR-21能够促进SMC增殖,抑制其凋亡。Maegdefessel等亦通过动物实验表明,在动物体内过表达miR-24能够抑制主动脉瘤的扩张。综上所述,多种miRNA可通过多不同途径参与主动脉瘤的发生,然而探索一种新的且十分有效的miRNA作为主动脉瘤的干预靶点仍是十分必要的。在本课题研究中,我们拟解决以下几个问题:(1)筛选TGFβ/SMAD信号通路上重要的miRNA,在胸主动脉瘤血管壁中检测表达及定位情况;(2)通过体外实验探索该miRNA对VSMCs生物学活性的影响;(3)探索该miRNA新的下游靶基因,并验证其功能;(4)通过构建主动脉特异性过表达miRNA的转基因小鼠,在体内观察该miRNA对主动脉瘤发生的影响。下文将就该四部分展开讨论。第一部分胸主动脉瘤中差异表达miRNA的筛选目的筛选在胸主动脉瘤中血管壁中具有显著表达差异的miRNA方法通过生物信息学分析,找出多个在TGFβ/SMAD信号通路上有重要作用的miRNA作为备选的待检测miRNA。利用TGFβ处理人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cell,h-VSMCs),并在其中检测相关 miRNA 的表达情况,筛选出表达差异最为显著的miRNA。以主动脉扩张1.5倍为主动脉瘤诊断标准,收集在长海医院心血管外科行胸主动脉瘤手术的患者的血管壁标本,其中排除家族遗传病或自身免疫病导致的动脉瘤、梅毒性动脉瘤、外伤性动脉瘤等。取心脏移植或主动脉瓣置换等患者主动脉壁作为正常对照组。在取得的标本中通过荧光定量PCR检测上述筛选出的miRNA,通过原位杂交在标本中检测该miRNA定位情况。结果RT-PCR结果提示在TGFβ通路相关的miRNA中,miR-494在TGFβ处理的h-VSMCs表达差异最为显著;在对组织标本的检测中,miR-494在胸主动脉瘤患者血管壁中表达显著下降,原位杂交提示miR-494主要定位于血管壁中层血管平滑肌细胞中。结论miR-494在胸主动脉瘤患者血管壁中表达水平低于正常组,且主要定位于血管壁中层。第二部分miR-494对血管平滑肌细胞生物学功能的影响目的探索miR-494对主动脉血管平滑肌细胞生物学功能的影响。方法培养原代h-VSMCs,待细胞性状及表型稳定后转至6孔板中,待细胞密度达70%,采用TGFβ (10ng/ml)处理h-VSMCs,于不同时间点检测miR-494表达,观察miR-494动态变化情况;同时检测表型转化相关基因随着时间点变化情况。同样方法培养h-VSMCs,待细胞密度达70%后采用Lipo2000转染miR-494-mimic,检测表型转化相关标志物(SM22, MYH11)等表达变化情况;Cck-8检测h-VSMCs增殖情况;划痕试验检测h-VSMCs迁移情况;ELISA检测h-VSMCs分泌功能改变。结果TGFβ能显著提高h-VSMCs中miR-494水平,且随时间点呈逐渐增强趋势;TGFβ能够促进收缩型相关基因表达,于刺激后72h达到表达高峰后开始下降。在TGFβ处理48h时通过转染miR-494-mimic提高h-VSMCs中miR-494水平能够促进抑制收缩型相关蛋白(SM22,MYH11)的表达,而在TGFβ处理72h后通过miR-494-inhibitor下调h-VSMCs中miR-494 水平,能够促进收缩型相关蛋白的表达。在h-VSMCs中过表达miR-494显著能够抑制收缩型相关蛋白的表达,促进h-VSMCs增殖和迁移;能够促进Collagen的表达,对Elastin表达无显著影响,能够显著抑制MMP2的分泌。结论TGFβ能够显著促进miR-494表达,当miR-494达到一定水平后,能够负反馈抑制TGFβ的作用;miR-494能够诱导h-VSMCs由合成型向收缩型转化;miR-494能够显著抑制MMP2的分泌。第三部分miR-494调节血管平滑肌细胞生物学功能的分子机制目的探索并确定miR-494的靶基因及靶基因的功能,探索miR-494抑制MMP2分泌的机制。方法通过多个数据库查询并整合miR-494潜在靶基因,进一步通过GO分析初步筛选miR-494可能的靶基因。构建荧光素酶报告基因质粒,通过萤光素酶报告实验确定miR-494的直接靶基因。通过Western Blot检测在h-VSMCs中过表达miR-494后靶基因的表达水平,通过拯救试验(Rescue试验)进一步验证靶基因及其功能。通过Western Blot检测miR-494可能抑制共结合蛋白聚糖-1 (Syndecan-1,SDC-1)表达,进而抑制了 MMP2的水平,并通过拯救实验明确了 SDC-1在miR-494抑制MMP2表达中的作用。结果通过多个数据筛选及GO分析,初步筛选了活化T细胞核因子5 (The Nuclear factor of activated T-cells 5,NFAT5)为 miR-494 的直接靶基因,进一步荧光素酶报告基因实验确定了 NFAT5与miR-494直接结合。进一步在h-VSMCs中过表达miR-494能够显著抑制NFAT5的表达水平。拯救试验证明miR-494可通过抑制NFAT5促进h-VSMCs的表型转化、增殖及迁移,过表达NFAT5能够逆转这一过程。过表达miR-494能够显著抑制h-VSMCs中SDC-1及MMP2的表达,而在过表达miR-494的同时提高SDC-1的水平,能够缓解miR-494对MMP2的抑制作用。结论miR-494可通过直接抑制NFAT5促进h-VSMCs表型转化、增殖及迁移。另一方面,miR-494通过SDC-1抑制MMP2的合成。第四部分体内实验探索miR-494对胸主动脉瘤发生发展的影响目的通过体内实验探索miR-494对主动脉瘤发生发展的影响。方法采用Apoe-/-小鼠配合人血管紧张素Ⅰ(AngiotensinⅡ,Ang Ⅱ)构建小鼠主动脉瘤模型,皮下注射miR-494抑制物miR-494-Antagomir后,通过小鼠主动脉超声检测主动脉瘤形成情况。通过HE染色和VB染色观察小鼠血管壁病理改变情况。构建主动脉血管壁特异性miR-494过表达的转基因小鼠,并利用该小鼠构建主动脉瘤,通过上述方法检测主动脉瘤形成情况及病理改变情况。通过ELISA检测、免疫组织化学染色及原位明胶酶谱法探索miR-494影响主动脉瘤发生发展的机制。结果Apoe--小鼠联合Ang Ⅱ能够有效构建主动脉瘤模型,miR-494-Antagomir注射组相对于模型组,主动脉内径扩张更明显,VB染色提示miR-494-Antagomir注射组血管壁中弹力纤维及胶原破坏亦更严重。miR-494转基因小鼠构建的主动脉瘤模型中,主动脉瘤扩张显著改善。VB染色提示转基因小鼠血管壁弹力纤维及胶原的破坏程度相较于野生型小鼠有所改善。ELISA检测结果提示miR-494过表达的转基因小鼠血浆中MMP2水平显著低于野生型小鼠,免疫组化亦证明过表达miR-494能够显著抑制小鼠血管壁中MMP2的表达,原位明胶酶谱结果提示miR-494能够抑制血管壁中MMPs的活性。结论体内试验表明过表达miR-494能够有效缓解模型小鼠主动脉瘤的发生发展,这种对血管的保护作用主要通过miR-494抑制MMPs的合成、分泌及活性实现。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.1
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本文编号：
2302430
