【摘要】：心肌梗死(myocardial infarction,MI)是冠心病的一种十分凶险的临床类别,具有发病急、病情进展快、程度重、近期和远期并发症多及预后差等特点,约50%的心血管系统疾病死亡事件可归因于MI。随着经济、社会等全球化进程的加速,MI已迅速成为世界第一位的死亡原因。MI后心律失常、心力衰竭等并发症是其不良预后的主要原因,其中心律失常尤其是各种形式的恶性室性心律失常(ventricular arrhythmia, VAs)是MI患者死亡的主要原因；有研究资料显示,大于50%的MI存活患者死于VAs事件。因此,越来越多的临床医师和科研工作者致力于MI后VAs发生机制及防治策略的探讨。随着近年来研究的逐步深入,心脏重构被认为是MI后一系列并发症发生的主要原因,其包含心肌重构、缝隙连接重构、自主神经重构及电重构等。研究提示,由缝隙连接介导的电冲动是维持正常心电功能的先决条件,其中心室肌细胞主要表达缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43),其相邻细胞之间的电耦联即由Cx43所组成的缝隙连接通道主导；各种病理状态下,Cx43的表达数量、分布方式和功能发生改变,即缝隙连接重构,均可能显著影响电冲动在心室肌细胞间传导的连续性、一致性,从而增加心律失常的诱发倾向。MI后交感神经重构与心律失常的关系近年来引起广大临床医生和科研人员的普遍关注。MI后心脏发生去神经纤维支配、神经出芽再生和交感神经过分再生和高支配,即为交感神经重构；在受损组织修复的同时这种非正常的神经重构增重了MI后心肌组织的电生理异质性,导致VAs易感性的增大。研究发现,炎症反应与MI后交感神经再生重构关系密切；巨噬细胞作为炎症反应的关键一环,可分泌神经生长因子(nerve growth factor,NGF),而NGF是神经再生的重要调控因素之一。巨噬细胞在不同环境条件刺激下,可发生表型转化,从而表现出功能截然不同的两个细胞亚群,即经典激活的M1型和替代性激活的M2型,二者是巨噬细胞功能上连续变化的两个极端,甚至互相抑制。M1型巨噬细胞参与炎症反应的启动和维持；而M2型巨噬细胞生成抗炎因子,终止破坏性的炎症反应,参与组织修复。研究发现,MI早期M1型巨噬细胞起主导作用。因此在MI发生后尽早有效抑制M1型巨噬细胞启动的炎症反应,调节NGF分泌表达,从而调控MI后交感神经再生重构,可能能够有效的防治MI后恶性VAs的发生、发展。ARB (angiotensin receptor blocker,ARB)在MI患者中的应用主要基于其可延缓MI后左心室重构、改善心功能等,其对MI后心肌组织心电生理特性影响如何,目前相关研究较少。LIFE试验、TRACE试验及AFFIRM试验等大型临床试验观察到,心功能不全和高血压病左心室肥厚患者使用血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI)和／或ARB后,新发房颤的发生率显著降低,提示二者均可能存在一定的抗心律失常作用；而有研究显示上述作用可能与ACEI和／或ARB可改善心房缝隙连接的重构有关,但二者对于MI后VAs的影响及具体机制的相关研究尚少。因此,我们推测MI后早期ARB干预可有效调控MI后缝隙连接重构,为MI后恶性VAs的防治提供新的理论依据和基础实验支持。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂(hydroxy methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor),又称为他汀类药物,在临床上广泛用于患者血脂水平的调节；其同时具有抗血小板聚集、抑制单核-巨噬细胞的粘附和分泌、抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移、抗心律失常等调脂之外的多种作用；其中就其如何发挥抗心律失常作用目前相关的研究较少；新近研究证实其可诱导巨噬细胞表型自M1型向M2型方向转变。因此,我们推测MI后早期他汀类药物干预可通过影响巨噬细胞的表型和功能来调控炎症反应,调节NGF的分泌表达,从而改善MI后交感神经再生重构,可能成为MI后恶性VAs防治的有效手段之一在课题组既往研究基础上,本研究拟通过建立MI动物模型,进一步证实缝隙连接重构、交感神经重构与VAs的关系,探讨MI后巨噬细胞表型转化与心脏交感神经重构的关系；并给予ARB缬沙坦、他汀类代表药物阿托伐他汀干预,以期揭示二者抗心律失常作用及可能机制,为降低MI后VAs的发生提供新的思路,并为临床上MI后ARB、他汀类药物的早期应用提供进一步的理论依据。为明确阐述以上问题,本课题通过以下两个部分进行探讨：第一部分缬沙坦对心肌梗死后室性心律失常的影响及机制的实验研究目的：明确MI后缝隙连接重构与VAs的关系,并行ARB缬沙坦干预研究,确定其具有抗心律失常作用,以期为MI后VAs的防治及ARB的临床拓展应用提供新的思路。方法：SD大鼠随机分成3组：假手术组(Sham组),心肌梗死组(MI组),ARB缬沙坦干预心肌梗死组(ARB组)。采用开胸结扎左冠状动脉制造MI大鼠模型,术后次日分别予以等容积生理盐水及缬沙坦(30 mg/kg/day)灌胃。继续喂养至8周,所有存活大鼠均行血流动力学检查,并接受活体程序电刺激试验以诱发VAs。每组各选取10只大鼠处死后立即取梗死灶周、非梗死左室游离壁(left ventricle free wall,LVFW),利用免疫组织化学、Westernblot及透射电镜等方法观察Cx43的分布及数量；剩余各组大鼠行心室肌细胞分离,利用膜片钳技术记录心室肌细胞瞬时外向钾电流(transient outward potassium current,Ito)电流密度并进行统计学分析,以评价缝隙连接通道的功能。结果：1.MI组大鼠VAs诱发率较Sham组显著增加(P0.01)；射血分数(ejectionfraction,EF)和心输出量(cardiac output, CO)较Sham组显著下降(P0.05), 左室收缩压(left ventricular systolic pressure,LVSP)和左室内压最大上升／下降速率(±dp/dtmax)亦显著降低(P0.05)；免疫组织化学显示与Sham组相应部位相比,梗死灶周心肌组织Cx43分布不均一,含量降低(0.215±0.017,0.330±0.024,P0.05),心室肌细胞Ito电流密度下降。2.与MI组相比,ARB组VAs诱发率显著下降(P0.01)；EF和CO显著升高,±dp/dtmax亦显著上升(P0.05),而左心室舒张末压力(left ventricleend-diastolic pressure,LVEDP)、LVSP下降(P0.05)；梗死灶周心室Cx43含量增加(0.330±0.024,P0.05)、分布不均一的程度减轻,Ito电流密度部分恢复。3.在LVFW,三组Cx43分布方式相对正常,但MI组Cx43含量与Sham组和ARB组相比显著下降(P0.05),而在Sham组和ARB组之间未发现显著差异。4.Western blot结果同上述；同时,电镜检查发现,ARB缬沙坦干预可在一定程度上恢复心肌梗死后异常的Cx43分布。结论：1.MI后缝隙连接表现出数量的减少,空间分布的异常及功能的改变等,即缝隙连接重构,使心肌组织电传导的一致性丧失,其是导致MI后VAs发生的机制之一；2.MI后ARB缬沙坦干预能有效改善MI所致的缝隙连接重构,部分恢复下降的Ito电流密度,从而降低MI后VAs的易感性和发生率。第二部分阿托伐他汀对心肌梗死后室性心律失常的影响及机制的实验研究目的：探讨MI后巨噬细胞表型转化与交感神经重构的关系,明确他汀类药物阿托伐他汀干预对MI后巨噬细胞表型的影响及与MI后交感神经重构的关系,为MI后由交感神经重构引发的恶性心律失常的防治提供新的靶点,并为他汀类药物在临床的拓展应用提供理论依据和基础实验支持。方法：Wistar大鼠随机分为3组：假手术组(Sham组),心肌梗死组(MI组),他汀类代表药物阿托伐他汀干预心肌梗死组(Statin组)。开胸行左冠状动脉结扎制造大鼠MI模型,术后当日分别给以等容积PBS溶液及阿托伐他汀(10mg/kg/day)灌胃。7天后,所有成活动物行程序性电刺激诱发VAs。分离大鼠腹腔巨噬细胞分别给以脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)+干扰素γ(interferionγ,IFN-γ)和白介素4(interleukin-4,IL-4)诱导细胞极化,选组1孔板LPS+IFN-γ诱导刺激的巨噬细胞给以阿托伐他汀干预,并利用流式细胞仪检测巨噬细胞极性,实时定量RT-PCR检测M1型巨噬细胞分泌的诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、M2型巨噬细胞分泌的精氨酸酶1(arginasel,Arg1)肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-a,TNF-a)口白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)相应mRNA的表达；利用免疫组织化学和免疫荧光染色的方法观察MI后梗死灶周巨噬细胞浸润情况及生长相关蛋白43(growth associated protein 43,GAP43)口酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经纤维的密度与分布；Western blot检测心肌组织中NGF蛋白表达；实时定量RT-PCR检测心肌中NGF相应mRNA的表达；ELISA检测血清中NGF浓度。结果：1.对于分离的腹腔巨噬细胞,流式细胞仪检测提示LPS+IFN-γ和IL-4分别成功诱导刺激巨噬细胞向M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞转化；LPS+IFN-γ诱导刺激的细胞给以阿托伐他汀干预后,CD86/CD68双染阳性表达率(CD86为M1型巨噬细胞标记物,CD68巨噬细胞为标记物)显著下降,提示阿托伐他汀确实可促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。2.对于分离的腹腔巨噬细胞,L PS+IFN-γIL-4诱导刺激组iNOS和Arg1水平与对照组比较显著不同(P0.01),提示巨噬细胞极性诱导转化成功。与对照组相比,LPS+IFN-y诱导刺激组IL-1β、TNF-α相应mRNA表达和IL-4诱导刺激组IL-1β、TNF-α相应mRNA表达显著升高(P0.01)；但IL-4诱导刺激组二者表达水平低于LPS+IFN-y诱导刺激组。LPS+IFN-y诱导刺激的细胞给予阿托伐他汀干预后可明显升高Arg 1表达；并逆转IL-1β、TNF-α目应mRNA的升高趋势(P0.01),提示阿托伐他汀干预后成功诱导M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。3.巨噬细胞浸润：MI组梗死灶周存在大量CD68阳性巨噬细胞,且数量显著高于Sham组(P0.01); CD163/CD68双染来标记M2型巨噬细胞(CD163为M2型巨噬细胞标记物),其在MI后第3天可计数到；与MI组相比,Statin组梗死灶周CD163阳性细胞计数显著增加(P0.01),证实在MI后早期给以阿托伐他汀干预可促进巨噬细胞表型从M1型向M2型的转化。4.NGF蛋白及1nRNA表达：与S ham相比,MI组NGF表达明显上调；给以阿托伐他汀干预后,NGF表达明显下调。同时,NGF阳性的巨噬细胞数量明显下降。5.神经支配：(1)GAP43阳性神经纤维：Sham组几乎不可见；与Sham组相比,MI组梗死灶周神经纤维密度显著增加；与MI组相比,Statin组神经密度显著降低；(2)TH阳性神经纤维：S ham组可见其与心肌纤维一致的走形,分布均匀；与Sham组相比,MI组梗死灶周神经密度显著增加,且形态异常、空间分布混乱；与MI组对比,Statin组神经密度显著降低,生长形态及空间分布接近于正常化。结论：1.MI后巨噬细胞极性转化可影响NGF的表达,进而调节交感神经重构。2.阿托伐他汀通过促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化,下调NGF表达。3.MI后早期阿托伐他汀的应用可调节巨噬细胞极化,改善交感神经重构,从而发挥其抗心律失常作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.22;R541.7
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本文编号：2303854
