萝卜硫素预处理保护心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究

发布时间：2018-11-13 12:43

【摘要】：研究背景《Lancet》发表全球疾病负担研究结果指出,在全球人群235种疾病的死亡原因中,缺血性心脏病居于首位。在过去的几十年间,尽管随着经皮冠状动脉介入术、冠状动脉搭桥术、抗血小板和抗凝药物等治疗方法有了突破,梗死阻塞的冠脉很快得到再通,但在缺血心肌恢复再灌注后,反而引起心脏功能的恶化和心肌的损伤,即缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤。I/R损伤导致心脏重构,是引起心力衰竭的主要原因,导致患者远期死亡率增加和生活质量下降。引起心肌I/R损伤的机制较多,但目前仍然不是非常明确。内质网(Endoplasmic Reticulum,ER)应激是导致心肌I/R损伤的重要机制之一,缺血缺氧等各种刺激因素作用于内质网,导致其功能紊乱,从而引起ER应激,ER应激参与了缺血再灌注病理生理变化过程中的多步反应,过久或者过强均会导致细胞的死亡,在小鼠I/R损伤模型的心肌细胞内可检测到ER应激标志物的升高。研究表明,ER应激诱导的凋亡是导致心肌缺血再灌注损伤的重要病理生理机制之一,减弱内质网应激可以保护心肌缺血再灌注损伤,因此,可通过调控ER应激及其诱导的凋亡来干预心肌I/R损伤。沉默信息调节因子2相关酶1(Silent information regulator 2 type 1,SIRT1)是哺乳动物中重要的NAD+依赖性去乙酰化酶,参与代谢、细胞生存、生物寿命的调节等重要的生理和病理过程。研究表明,激活SIRT1具有保护心肌损伤的作用,可以将其视为治疗心肌I/R的一个新的靶点。然而,SIRT1在心血管疾病的预防和治疗的确切作用仍知之甚少。ER应激和SIRT1信号通路目前均被认为是决定心肌细胞的生存与死亡的重要因素,研究发现,两者之间存在密切的联系,但它们在心肌I/R中的作用机制尚不明确。自噬在心肌缺血／再灌注中具有重要的作用,既往对I/R损伤的研究机制大部分聚焦在心肌坏死和凋亡,但最近研究表明,自噬功能紊乱可能使心脏更易发生缺血／再灌注损伤以及心梗后心脏重塑,甚至触发细胞凋亡及坏死的发生,说明自噬对心脏有害。然而似乎矛盾的是,更多的研究表明自噬在心肌缺血／再灌注损伤的缺血阶段时对心肌具有保护作用。鉴于此,自噬在心肌I/R损伤中作用需要进一步探讨。目前关于心肌细胞自噬和凋亡的相互关系已成为一个研究热点。研究表明自噬具有抑制凋亡保护心肌细胞的作用。自噬的调节是一个非常复杂的过程,其信号转导分子机制非常复杂,AMPK/mTOR信号通路是目前比较明确的一个,mTOR被认为是哺乳动物中自噬的负调节物,能接受多种上游信号,细胞在缺血缺氧状态时激活AMPK,通过抑制mTOR而诱导自噬,自噬与AMPK/mTOR信号通路的相互反馈调控作用能够促进细胞的存活。萝卜硫素(Sulforaphane, SFN)是一种来源于西兰花、芥蓝等十字花科植物的异硫氰酸盐,作为一种间接抗氧化剂能够诱导激活Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因,从而具有抗氧化应激、抗炎、抗肿瘤和心血管保护的作用。被认为是截至目前发现的所有天然抗癌物质里,效力最强、效果最好的活性成分。综上所述,我们提出假说：1、萝卜硫素预处理通过激活SIRT1抑制内质网应激依赖的凋亡保护心肌细胞缺氧／复氧损伤；2、萝卜硫素预处理通过AMPK/mTOR通路诱导自噬抑制凋亡保护小鼠心肌缺血／再灌注损伤。本实验拟建立离体新生乳鼠心肌细胞缺氧／复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)模型及在体小鼠心肌I/R模型,来探讨萝卜硫素对心肌细胞缺血／再灌注损伤的保护作用及可能的机制,从而为其今后应用于临床提供理论依据。目的1.建立乳鼠心肌细胞H/R模型,离体水平证实萝卜硫素预处理激活SIRT1信号通路抑制内质网应激依赖的凋亡保护心肌细胞缺氧／复氧损伤；2.建立乳鼠心肌细胞H/R模型和小鼠心肌I/R模型,整体水平证实萝卜硫素预处理通过AMPK/mTOR通路诱导自噬抑制凋亡保护小鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤。对象与方法第一部分本部分实验采用新生乳鼠(1～2 d)分离培养原代心肌细胞,制备缺氧／复氧模型模拟缺血／再灌注。实验分为4步：第1步,探索最佳H/R造模时间。将分离培养后的心肌细胞随机分为5组：Con(对照组)；H3/R3组(缺氧3小时／复氧3小时)；H3/R6组、H3/R9组；H3/R12组。通过倒置显微镜观察心肌细胞搏动和形态学变化,MTS法检测心肌细胞活性,Elisa试剂盒检测细胞培养液中LDH活性检测心肌细胞损伤程度。第2步,探索SFN保护原代心肌细胞H/R损伤的最佳药物浓度。将培养的心肌细胞分为6组：Con组；缺氧／复氧组(H/R)：缺氧培养3小时,复氧培养3小时；不同浓度SFN预处理组(0.1μ,M,0.5μM,1μM,5μM)；通过MTS法检测心肌细胞活性,Elisa试剂盒检测细胞培养液中细胞内丙二醛(Malonydialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)检测SFN对原代心肌细胞H/R损伤的保护作用。第3步,探索SFN是否具有通过抑制内质网应激依赖的凋亡保护心肌H/R损伤。将心肌细胞分为4组：Con组；SFN组：5μMSFN加入正常孵育条件下的心肌细胞中；H/R组：缺氧培养3小时,复氧培养3小时；SFN+H/R组：5μMSFN提前1h在缺氧复氧造模前加入心肌细胞。通过TUNEL法检测凋亡指数,Caspase-3活性检测试剂盒检测凋亡蛋白酶Caspase-3活性,免疫印迹法(Western blot)检测抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表达水平观察细胞凋亡水平、内质网应激相关标志蛋白GRP78、CHOP和Cleaved caspase-12蛋白判断内质网应激水平。第4步,探索SFN是否通过激活SIRT1通路抑制内质网应激依赖的凋亡保护心肌H/R损伤。将心肌细胞分为6组：Con组；EX-527组(E)：抑制剂1μMEX-527提前1小时加入正常培养的原代心肌细胞中；H/R组：原代心肌细胞缺氧培养3小时,复氧培养3小时；E+H/R组：1μMEX-527在H/R造模前加入心肌细胞培养液中；SFN+H/R组；SFN+E+H/R组。通过JC-1探针检测线粒体膜电位,MTS检测细胞活性,免疫印迹法检测SIRT1、内质网应激相关蛋白(GRP78、CHOP、Cleaved caspase-12)、抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达水平。第二部分本部分实验通过培养原代心肌细胞制备H/R模型以及采用野生型单一雄性C57BL/6小鼠构建小鼠心肌缺血／再灌注损伤模型。实验分为5步：第1步,探索H/R能否在原代心肌细胞中诱导出自噬和凋亡现象,并探索与造模时间的关系。培养的原代心肌细胞分为6组：Con组(对照组)；H3/R3组；H3/R6组；H3/R9组；H3/R12组；H3/R24组。通过免疫印迹法(Western blot)检测LC3-Ⅱ蛋白表达自噬水平；通过TUNEL法检测细胞凋亡率。第2步,探索自噬是否能抑制凋亡保护心肌细胞H/R损伤。培养的原代心肌细胞分为4组：Con组；缺氧／复氧组(H/R)：原代心肌细胞缺氧培养3小时,复氧培养3小时；3-MA组：自噬抑制剂3-MA提前1h在缺氧／复氧造模前加入心肌细胞；Rapa组：自噬激动剂Rapamycin提前1h在缺氧／复氧造模前加入心肌细胞；通过自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3和LC3-Ⅱ蛋白、P62蛋白表达检测自噬流；通过TUNEL法检测凋亡指数及Bcl-2蛋白、Bax蛋白表达水平检测凋亡水平。第3步,探索SFN能否促进自噬抑制凋亡保护原代心肌细胞H/R损伤。原代心肌细胞分为5组：Con组；缺氧／复氧组(H/R)；SFN组：5μMSFN+缺氧／复氧组；SFN+3-MA组：3-MA+SFN+H/R; SFN+Rapa组：Rapa+SFN+H/R;通过自噬双标腺病毒]mRFP-GFP-LC3和LC3-Ⅱ蛋白、P62蛋白表达检测自噬流；通过TUNEL法检测凋亡指数及Bcl-2蛋白、Bax蛋白表达水平检测凋亡水平。第4步,在体水平上SFN能否促进自噬保护小鼠心肌I/R损伤诱导的凋亡。小鼠分为7组：假手术组(Sham);缺血／再灌注组(I/R)：缺血45min,再灌注2h；SFN组：5μM SFN在缺血／再灌注之前24h和1h提前腹腔注射入体内；Wor组：自噬抑制剂Wortmannin在缺血／再灌注之前24h和1h提前腹腔注射入体内；Rapa组;SFN+Wor组;SFN+Rapa组。通过投射电镜观察自噬小体和Western blot检测LC3-Ⅱ蛋白、P62蛋白表达检测自噬流；通过TUNEL法检测凋亡指数及Bcl-2蛋白、Bax蛋白表达水平表示凋亡水平。第5步,SFN通过AMPK/mTOR促进自噬保护H/R损伤诱导的凋亡。心肌细胞分为5组：Con组；I/R组；SFN组；CC组：AMPK抑制剂Compound C组提前1h在缺氧／复氧造模前加入心肌细胞；SFN+CC组。通过自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3和LC3-Ⅱ蛋白、P62蛋白表达检测自噬流；通过Western blot检测AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平。采用SPSS19.0软件进行统计学分析,所有计量资料用均数±标准差表示(x±s),首先对各组数据进行方差齐性检验和单因素方差分析,方差齐时,多重比较选用最小显著差值法(Least-significant Difference, LSD),若方差不齐时,采用近似F检验(Welch法),多重比较采用Dunnett's T3方法,以P0.05认为差异有统计学意义。结果第一部分3.1缺氧/复氧时间对原代心肌细胞形态的影响倒置相差显微镜观察新接种的心肌细胞形态呈球形悬浮于培养液中,培养4h后开始贴壁生长,变为圆形或者椭圆形,后变为梭形,并逐渐伸出伪足,变为不规则形状。逐渐伸出伪足呈星形,交织成网。细胞搏动呈同步性,收缩明显有力。H3/R3组细胞存活减少,细胞搏动紊乱,随着复氧时间的延长,H3R6组、H3R9组心肌细胞存活率减少,细胞搏动微弱,镜下可发现部分死亡细胞漂浮于培养液表面,H3R12组细胞活力最差,部分细胞无搏动。3.2不同缺氧/复氧时间对原代心肌细胞损伤的影响利用MTS法检测原代心肌细胞存活率,结果显示,与对照组相比,各缺氧／复氧造模组的细胞活性率均下降,差异均具有统计学意义(P0.01)；与H3/R3组比较,其他缺氧／复氧造模组均具有显著统计学差异(P0.01)。同时我们用LDH试剂盒检测了细胞培养液的LDH活性,结果显示,与对照组比较,H3/R3的活性增高,各缺氧／复氧造模组LDH活性随着复氧时间的延长明显增高,差异均具有统计学意义(P0.01)。H3/R6组与H3/R9组比较,两者无显著差异(P=0.125)；H3/R9组与H3/R12组比较,两者差异无统计学意义(P=0.288)。表明复氧后期,细胞损伤及存活率的下降慢慢减小,表明H3/R3是最佳的造模时间。3.3萝卜硫素保护原代心肌细胞H/R损伤的最佳药物浓度利用MTS法检测原代心肌细胞存活率,结果显示,与对照组相比,H/R组的细胞存活率明显下降,差异均具有统计学意义(P0.01)；与H/R组比较,各浓度萝卜硫素组均可以改善原代心肌细胞缺氧／复氧造成的损伤,均具有显著统计学差异(P0.01)；尤以5μM效果最明显(88.61±2.73%vs.52.11±2.05%)。分别应用MDA和SOD检测试剂盒检测体外培养各组心肌细胞中MDA含量和SOD活性,结果显示,与对照组细胞相比,H/R组心肌细胞的MDA增加(2.94±0.82 vs.0.72±0.06,P0.01),SOD减少(76.05±14.89 vs.142.21±7.55),差异均具有统计学意义(P0.01)。各浓度萝卜硫素(0.5μM,1μM,5μM)预处理组与H/R组相比,MDA降低,SOD增加,且差异均具有统计学意义(P0.01),尤其以5μM萝卜硫素组明显。3.4萝卜硫素预处理减弱原代心肌细胞H/R诱导的凋亡我们利用TUNEL法进行染色观察细胞凋亡情况,结果显示,与对照组相比,H/R组和H/R+SFN组细胞凋亡指数增加,差异均具有显著统计学意义(P0.01),而单纯SFN组凋亡指数稍降低,差异无统计学意义(P0.05)。与H/R组比较,H/R+SFN组细胞凋亡指数降低,且差异具有统计学意义(31.13±3.70% vs.45.90±3.45%,P0.01)。我们应用Caspase-3试剂盒检测各组细胞的Caspase-3活性,结果显示,单纯SFN组凋亡指数稍降低,差异无统计学意义(P0.05)。与正常对照组比较,H/R组细胞Caspase-3活性显著升高(P0.001)。单纯SFN组及SFN+H/R组与H/R组两两比较,Caspase-3活性较H/R组均显著降低(P0.001)。3.5萝卜硫素预处理抑制原代心肌细胞H/R损伤所致内质网应激依赖的凋亡我们应用Western blot法检测内质网标志蛋白及凋亡蛋白表达,结果显示：与对照组相比,H/R组的3个内质网应激标志蛋白(GRP78、CHOP、Cleaved caspase-12)表达均增强,差异均具有统计学意义(P均0.01)。与H/R组比较,单纯SFN预处理组和SFN+H/R组的三个ER应激标志蛋白表达降低,差异均具有统计学意义(P0.01)。我们同时研究了抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达,结果显示,与对照组相比,H/R组和H/R+SFN组的Bcl-2/Bax表达比值均有下降,差异均具有显著统计学意义(P0.01),而单纯SFN组Bcl-2/Bax表达比值稍有增高,但差异无统计学意义(P0.05)。与H/R组比较,H/R+SFN组的Bcl-2/Bax表达比值升高,且差异具有统计学意义(0.72±0.06 vs.0.53±0.07,P0.01)。3.6萝卜硫素预处理激活SIRT1通路保护心肌H/R损伤我们用Western blot检测了SIRT1蛋白在各组间的表达,结果显示,与对照组相比,H/R组差异不具有显著统计学意义(P0.05)。而单纯SFN组和H/R+SFN组均具有统计学差异(P0.01)。我们进一步检测了各组的SIRT1活性,结果显示,与对照组相比,H/R组SIRT1活性明显减低(40.67±5.50% vs.99.00±4.00%),差异具有显著统计学意义(P0.05)。与H/R组相比较,H/R+SFN组的SIRT1活性明显升高,具有统计学差异(P0.01)。3.7萝卜硫素预处理改善线粒体膜电位,EX-527可以阻断此作用我们采用JC-1荧光探针应用激光共聚焦显微镜检测各实验组的线粒体膜电位(△Ψm),结果显示,与对照组相比,H/R组线粒体膜电位明显减低,差异具有显著统计学意义(P0.05)。与H/R组比较,SFN预处理可以改善线粒体膜电位(0.71±0.03 vs.0.36±0.03),均具有统计学差异(P0.01)。与H/R+SFN组比较,H/R+SFN+EX-527组线粒体膜电位明显减低(P0.01)。我们也研究了EX-527对原代心肌细胞存活率的影响,结果显示,与对照组相比,EX-527和H/R组细胞存活率明显减低,差异具有统计学意义(P0.05),表明H/R模型造模成功；同时也表明EX-527有部分毒性作用。与H/R组比较,萝卜硫素预处理可以改善细胞存活率(87.05±3.37%vs.52.67±3.05%),具有统计学差异(P0.05)。与H/R+SFN组比较,]H/R+SFN+EX-527组细胞存活率明显减低,表明萝卜硫素保护细胞的作用被EX-527阻断。3.8萝卜硫素预处理抑制原代心肌细胞H/R损伤所致的内质网应激依赖的凋亡我们加入了SIRT1抑制剂后检测各组的蛋白表达,想通过阻断SIRT1信号通路进一步验证我们的假设,结果显示：与对照组相比,H/R组的3个内质网应激标志蛋白(GRP78、CHOP、Cleaved caspase-12)表达均增强,均具有统计学差异(P均0.01)。与H/R组比较,SFN+H/R组均明显减低上述各值,具有显著统计学差异(P0.01)。与SFN+H/R组比较,H/R+SFN+EX-527组数值明显增高(P0.01)。我们同时研究了抗凋亡蛋白Bcl-2/促凋亡蛋白Bax的表达与EX-527的关系,结果显示,与对照组相比,H/R组的Bcl-2/Bax表达比值均有下降(0.27±0.03 vs.0.63±0.04),差异均具有显著统计学意义(P0.01)。与H/R组比较,H/R+SFN组的Bcl-2/Bax表达比值升高,且差异具有统计学意义(0.49±0.04 vs.0.27±0.03,P0.01)。与SFN+H/R组比较,H/R+SFN+EX-527组数值明显降低(0.29±0.03 vs.0.49±0.04,P0.01)。3.9萝卜硫素预处理通过SIRT1通路保护原代心肌细胞H/R损伤我们研究萝卜硫素是否通过激活SIRT1通路抑制内质网应激依赖的凋亡,结果显示,与对照组相比,H/R组差异不具有显著统计学意义(P0.05)。与H/R组比较,H/R+SFN组两者间差异具有统计学意义(P0.01)；而与H/R+SFN组比较,H/R+SFN+EX-527组数值明显降低,具有统计学意义(P0.05)。我们再次检测了各组的SIRT1活性,结果显示,与对照组相比,H/R组SIRT1活性明显减低(40.67±5.51% vs.99.00±4.00%),差异具有显著统计学意义(P0.05)。与H/R组比较,H/R+SFN组两者间差异具有统计学意义(P0.01)；而与H/R+SFN组比较,H/R+SFN+EX-527组数值明显降低(P0.01),表明萝卜硫素是通过SIRT1通路保护心肌H/R伤的作用。第二部分3.1 H/R能在原代心肌细胞中诱导出自噬和凋亡为了解心肌细胞H/R损伤是否可诱导自噬,我们用Western blot检测自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的水平。结果显示,与对照组相比,各H/R造模组的LC3-Ⅱ表达比值均有明显升高,H3/R3组自噬水平达到顶峰,(P0.01)；与H3/R3组比较,其他缺氧／复氧造模组随着复氧时间的延长,自噬水平逐渐下降(P0.01)。我们同时利用TUNEL法检测了凋亡指数,结果显示：与对照组相比,H3/R3组的凋亡率最高,随着复氧时间的延长,凋亡指数逐渐下降,呈时间依赖性,差异均具有统计学意义(P0.01)；H3/R3时自噬和凋亡均最强,便于研究其两者相互关系,所以我们选择H3/R3作为最佳造模时间。3.2自噬能保护原代心肌细胞H/R损伤诱导的凋亡为了研究自噬和凋亡的关系,我们首先利用Western blot检测了自噬标志蛋白,结果显示,与对照组相比,H/R组的LC3-Ⅱ蛋白表达水平明显升高,其差异具有统计学意义(P0.05)；与H/R组比较,自噬抑制剂3-MA明显抑制LC3-Ⅱ水平,升高P62水平,差异均具有统计学意义(P0.01)。而自噬激动剂Rapa导致LC3-Ⅱ水平明显升高,P62降低,差异均具有统计学意义(P0.01)。各组凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达结果显示,与对照组相比,H/R组的Bcl-2水平明显降低,Bax水平明显升高,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与H/R组比较,3-MA组Bcl-2水平明显下降,Bax水平增加(P0.01)。而Rapa组Bcl-2水平明显升高,Bax水平下降(P0.01)。我们同时利用自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3,结果显示,与对照组相比,H/R组的GFP/mRFP及mRFP水平明显升高,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与H/R组比较,3-MA组GFP/mRFP及mRFP水平均下降,差异具有统计学意义(P0.01)。而Rapa组则相反,GFP/mRFP和mRFP均增高,均具有统计学意义(P0.05)。我们同时应用TUNEL法检测了细胞凋亡,结果显示：与对照组相比,H/R组的凋亡指数明显升高,差异均具有统计学意义(P0.01)；与H/R组比较,自噬抑制剂3-MA组凋亡指数水平明显增高,差异具有统计学意义(P0.01)。而自噬激动剂Rapa组水平出现明显下降,差异具有统计学意义(P0.05)。3.3 SFN能在原代心肌细胞H/R损伤时促进自噬保护凋亡我们接着探索SFN是否能诱导自噬保护凋亡,结果显示,与对照组相比,H/R组的LC3-Ⅱ水平明显升高,其差异具有统计学意义(P0.05)；与H/R组比较,SFN组的LC3-Ⅱ的水平明显升高,P62明显减低,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与SFN组比较,SFN+3-MA组明显抑制LC3-Ⅱ水平下降,P62水平升高,差异具有统计学意义(P0.01)。而SFN+Rapa组LC3-Ⅱ水平稍微升高,P62水平稍降低,差异不具有统计学意义(P0.05)。各组凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax检测结果显示,与对照组相比,H/R组的Bcl-2水平明显降低,Bax水平明显升高,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与H/R组比较,SFN组Bcl-2水平明显升高,Bax水平明显降低,差异具有统计学意义(P0.01)。与SFN组比较,SFN+3-MA组的Bcl-2明显下降,而Bax明显升高,差异具有统计学意义(P0.01),而SFN+Rapa组Bcl-2水平稍微升高,Bax稍微降低,差异均不具有统计学意义(P0.05)。我们同时利用自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3检测自噬,与对照组相比,H/R组的GFP/mRFP和mRFP水平明显升高(P0.05)；与H/R组比较,SFN组GFP/mRFP和mRFP水平明显升高,差异具有统计学意义(P0.01)。与SFN组比较,SFN+3-MA组GFP/mRFP和mRFP水平出现下降,差异均具有统计学意义(P0.05)。与SFN组比较,SFN+Rapa组GFP/mRFP和mRFP升高,差异不具有统计学意义(P0.05)。我们同时应用TUNEL法检测了细胞凋亡,结果显示：与对照组相比,H/R组的凋亡指数明显升高,差异均具有统计学意义(P0.01)。与H/R组比较,SFN组凋亡指数明显降低,差异具有统计学意义(P0.01)。与SFN组比较,SFN+3-MA组凋亡指数水平升高,差异具有统计学意义(P0.05),而SFN+Rapa组凋亡指数水平出现下降,差异不具有统计学意义(P0.05)。3.4 SFN预处理可减少小鼠缺血/再灌注损伤后心肌梗死面积萝卜硫素预处理后检测小鼠心肌梗死面积,结果显示,与对照组相比,I/R组的INF/AAR和INF/LV的水平均明显升高,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与I/R组比较,SFN组的INF/AAR和INF/LV的水平明显减低,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与I/R组比较,Wor组的INF/AAR和INF/LV的水平明显升高,其差异均具有统计学意义(P0.05),而Rapa组INF/AAR和INF/LV明显升高,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与SFN组比较,SFN+Wor组INF/AAR和INF/LV水平升高,差异具有统计学意义(P0.01)。而SFN+Rapa组INF/AAR和INF/LV水平稍降低,差异不具有统计学意义(P0.05)。3.5 SFN预处理可减少缺血/再灌注损伤后血清CK及LDH的活性Elisa试剂盒检测再灌注2小时后小鼠血清CK及LDH的活性,结果显示,与对照组相比,I/R组的CK和LDH的水平均明显升高,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与I/R组比较,SFN组的CK、LDH均明显减低,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与I/R组比较,Wor组CK、LDH的水平明显升高,其差异均具有统计学意义(P0.05),而Rapa组CK、LDH的水平均明显降低,,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与SFN组比较,SFN+Wor组CK、LDH水平均升高,差异具有统计学意义(P0.01)。而SFN+Rapa组CK、LDH均降低,差异不具有统计学意义(P0.05)。3.6 SFN预处理促进自噬保护小鼠心肌缺血/再灌注损伤诱导的凋亡我们接着探索在动物层面SFN是否具有诱导自噬保护凋亡的作用,结果显示,与对照组相比,I/R组的LC3-Ⅱ水平明显升高,其差异具有统计学意义(P0.05)；与I/R组比较,SFN组的LC3-Ⅱ的水平明显升高,P62明显减低,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与I/R组比较,Wor组的LC3-Ⅱ的水平明显降低,P62明显升高,其差异均具有统计学意义(P0.05),而Rapa组LC3-Ⅱ的水平明显升高,P62明显减低,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与SFN组比较,SFN+Wor组明显抑制LC3-Ⅱ水平下降,P62水平升高,差异具有统计学意义(P0.01)。而SFN+Rapa组LC3-Ⅱ水平稍微升高,P62水平稍降低,差异不具有统计学意义(P0.05)。各组凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax,结果显示,与对照组相比,I/R组的Bcl-2和Bax的水平均明显升高,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与I/R组比较,SFN组的Bcl-2的水平明显升高,Bax明显减低,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与UR组比较,Wor组Bcl-2的水平明显降低,Bax明显升高,其差异均具有统计学意义(P0.05),而Rapa组Bcl-2的水平明显升高,Bax明显减低,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与SFN组比较,SFN+Wor组Bcl-2水平下降,Bax水平升高,差异具有统计学意义(P0.01)。而SFN+Rapa组Bcl-2水平稍微升高,Bax水平稍降低,差异不具有统计学意义(P0.05)。我们同时利用投射电镜观察自噬小体个数,结果显示,与对照组相比,I/R组的自噬小体水平明显升高,其差异具有统计学意义(P0.05)；与I/R组比较,SFN组和Rapa组自噬小体水平明显升高,Wor组明显减低,差异具有统计学意义(P0.01)。与SFN组比较,SFN+Wor组自噬小体水平出现下降,差异具有统计学意义(P0.05)。与SFN组比较,SFN+Rapa组自噬小体增多(P0.05)。我们同时应用TUNEL法检测了细胞凋亡,结果显示：与对照组相比,I/R组的凋亡指数明显升高,差异均具有统计学意义(P0.01)。与I/R组比较,SFN组和Rapa组凋亡指数明显降低,而Wor组凋亡指数稍微增高(P0.01)。与SFN组比较,SFN+Wor组凋亡指数水平升高,差异具有统计学意义(P0.05),而SFN+Rapa组凋亡指数水平出现下降,差异不具有统计学意义(P0.05)。3.7 SFN通过AMPK/mTOR促进自噬抑制凋亡保护H/R损伤我们接着探讨了SFN诱导自噬的信号通路,结果显示,与对照组相比,H/R组LC3-Ⅱ水平均明显升高,其差异具有统计学意义(P0.05)；与H/R组比较,SFN组的LC3-Ⅱ水平明显升高,P62明显降低；SFN+CC组明显抑制LC3-Ⅱ水平,而P62水平提高,自噬水平下降,差异具有统计学意义(P0.01)。我们同时利用自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3B检测自噬点数,结果显示,与对照组相比,H/R组的GFP/mRFP和mRFP水平明显升高(P0.05)；与H/R组比较,SFN组和Rapa组GFP/mRFP和mRFP水平明显升高,差异具有统计学意义(P0.01)。与H/R组比较,3-MA组GFP/mRFP和mRFP水平降低(P0.05)。与Rapa组与SFN组比较,SFN+3-MA组GFP/mRFP和mRFP水平出现下降,差异均具有统计学意义(P0.05)。与SFN组比较,SFN+Rapa组GFP/mRFP和mRFP升高,差异不具有统计学意义(P0.05)。同时检测了各组p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR蛋白表达比值,结果显示,与对照组相比,H/R组的p-AMPK/AMPK明显升高,而p-mTOR/mTOR降低,其差异均具有统计学意义(P0.05)；与SFN组比较,CC组和SFN+CC组的p-AMPK/AMPK明显降低,而p-mTOR/mTOR升高,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论1.萝卜硫素预处理通过激活SIRT抑制内质网应激依赖的凋亡保护心肌细胞缺氧复氧损伤；2.萝卜硫素预处理通过AMPK/mTOR通路诱导自噬抑制凋亡保护小鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

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