亲环蛋白A通过调控自噬促进ox-LDL诱导RAW264.7细胞的活化与凋亡

发布时间：2018-12-12 20:09

【摘要】：目的本实验主要在细胞水平探讨亲环蛋白A是否通过调控自噬水平促进氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导RAW264.7单核巨噬细胞的活化与凋亡。方法体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,应用蛋白质印迹法(Western blot)检测亲环蛋白A、β-actin、LC3、beclin-1、bcl-2、ABCA1及CD36的蛋白表达;ELISA法检测细胞培养上清中亲环蛋白A的蛋白含量;应用小干扰RNA沉默亲环蛋白A的表达,并应用western blot检测沉默效果;应用电镜观察细胞内自噬体的形成;应用GFP-RFP-LC3病毒感染细胞观察自噬流强弱;应用油红染色观察细胞内脂质沉积;应用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测细胞表面CD80、CD86及MHCII的阳性率;应用Tunel法检测细胞凋亡率。结果(1)ox-LDL(100mg/L)刺激24h后RAW264.7细胞亲环蛋白A蛋白水平显著升高,在6h达到高峰(p0.05);细胞培养上清中亲环蛋白A蛋白水平在24h内随时间梯度上升(p0.05)。(2)应用转染小干扰RNA沉默亲环蛋白A表达后,再予ox-LDL刺激0,6,12及24h后,亲环蛋白A沉默组中自噬相关蛋白LC3II/I水平较阴性对照组显著降低(p0.05);Beclin-1水平没有在两组间没有显著差异;电镜观察,亲环蛋白A沉默组细胞内自噬体显著降低于阴性对照组(p0.05)。(3)预先感染GFP-RFP-LC3腺病毒后,再用ox-LDL干预24h,亲环蛋白A沉默组的细胞中GFP—RFP+光斑数(自噬溶酶体)较阴性对照组显著升高(p0.05)。(4)ox-LDL干预24h后,亲环蛋白A沉默组的ABCA1蛋白水平显著升高,CD36蛋白水平显著降低,与阴性对照组相比(p0.05);亲环蛋白A沉默组细胞内脂质沉积较阴性对照组显著降低(p0.05)。(5)ox-LDL干预24h后,Cy PA沉默组细胞CD80、CD86及MHCII阳性率较阴性对照组显著降低(p0.05),而当提前使用自噬抑制剂3-MA预刺激1h后再予ox-LDL干预后,两组间CD86及MHCII的无显著差异(p0.05)。(6)Ox-LDL干预24h后,亲环蛋白A沉默组细胞凋亡率较阴性对照组显著降低(p0.05),而当提前使用自噬抑制剂3-MA预刺激1h后再予ox-LDL干预后,两组间细胞凋亡率无显著差异(p0.05)。结论(1)ox-LDL可以刺激RAW264.7细胞亲环蛋白A表达升高并分泌到细外。(2)亲环蛋白A促进ox-LDL诱导RAW264.7细胞的自噬,抑制自噬流。(3)亲环蛋白A促进ox-LDL干预后RAW264.7细胞内脂质沉积。(4)亲环蛋白A通过调控自噬促进ox-LDL诱导RAW264.7细胞的活化及凋亡。
[Abstract]:Aim to investigate whether cyclin A can promote the activation and apoptosis of RAW264.7 mononuclear macrophages by regulating autophagy level and promoting oxidized low density lipoprotein (oxidized low density lipoprotein,ox-LDL). Methods the expression of cyclin A, 尾-actin,LC3,beclin-1,bcl-2,ABCA1 and CD36 in murine macrophages cultured in vitro was detected by Western blot (Western blot). ELISA method was used to detect the protein content of cyclophile protein A in the supernatant of cell culture, small interference RNA was used to silence the expression of cyclin A and western blot was used to detect the silencing effect, and electron microscope was used to observe the formation of autophagy. The intensity of autophagy was observed by GFP-RFP-LC3 virus infection, the lipid deposition was observed by oil red staining, and the positive rates of CD80,CD86 and MHCII on cell surface were detected by flow cytometry (Flow Cytometry,FCM). Apoptosis rate was detected by Tunel assay. Results (1) after ox-LDL (100mg/L) stimulation for 24 h, the level of cyclin A protein in RAW264.7 cells increased significantly and reached its peak at 6 h (p0.05). The level of cyclin A protein in the supernatant of cell culture increased with time gradient (p0.05). (2) within 24 hours. After transfection of small interfering RNA, the expression of cyclin A was silenced, and then stimulated by ox-LDL for 12 and 24 hours. The level of autophagy associated protein LC3II/I in the silencing group was significantly lower than that in the negative control group (p0.05). There was no significant difference in Beclin-1 level between the two groups. Electron microscope observation showed that the intracellular autophagy in the cyclin A silencing group was significantly lower than that in the negative control group (p0.05). (3) after preinfection with GFP-RFP-LC3 adenovirus, and then treated with ox-LDL for 24 h. The number of GFP-RFP spots (autophagy lysosomes) in the cells of the cyclophile A silencing group was significantly higher than that of the negative control group (p0.05). (4) ox-LDL for 24 h, and the ABCA1 protein level in the cyclin A silencing group was significantly higher than that in the negative control group (p0.05). (4). The level of CD36 protein was significantly lower than that of negative control group (p0. 05). The intracellular lipid deposition in cyclophile A silencing group was significantly lower than that in the negative control group (p0.05). (5). The positive rates of CD80,CD86 and MHCII in the, Cy PA silencing group were significantly lower than those in the negative control group after 24 hours of ox-LDL intervention (p0.05). However, there was no significant difference in CD86 and MHCII between the two groups after pretreatment with autophagy inhibitor 3-MA for 1 h and then ox-LDL for 24 h (p0.05). (6) Ox-LDL intervention. The apoptosis rate of cyclin A silencing group was significantly lower than that of negative control group (p0.05), but there was no significant difference in apoptosis rate between the two groups after pretreatment with 3-MA for 1 hour and then with ox-LDL (p0.05). Conclusion (1) ox-LDL can stimulate the expression of cyclin A in RAW264.7 cells and secrete to the outside. (2) Cyclophile A can promote the autophagy of RAW264.7 cells induced by ox-LDL. Inhibition of autophagy. (3) Cyclophile A promoted lipid deposition in RAW264.7 cells after ox-LDL intervention. (4) Cyclophile A promoted the activation and apoptosis of RAW264.7 cells induced by ox-LDL by regulating autophagy.
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

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本文编号：2375177