ORMDL3基因导致动脉粥样硬化易感及机制研究

发布时间：2018-12-13 03:39

【摘要】：研究背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一种累及动脉血管壁的由脂质代谢异常引起的慢性免疫炎症性疾病。目前在全球范围内,由AS引发的心脑血管疾病始终处于疾病死亡谱的前列。AS是冠状动脉疾病(Coronary Artery Disease, CAD)、脑卒中(Stroke)、动脉瘤(Aneurysm)及外周动脉疾病(Peripheral Artery Disease)的共同病理学基础。AS隶属复杂疾病,是由环境因素和遗传因素共同作用产生的结果。AS的发病机制目前尚不明确,而对AS遗传机制的详细阐释亦处于起步阶段。凭借全基因组关联分析(Genome Wide Association Study, GWAS)技术,目前人类发现的AS易感基因或位点有50个以上,然而多数尚未得到稳健验证,其功能相关性也不甚清楚。2007年的一项针对支气管哮喘(Bronchial Asthma,下面简称哮喘)的GWAS证实ORMDL3基因(ORMDL sphingolipid biosynthesis regulator 3)为哮喘的易感基因,这一结果后在全球多个人群中得以验证。之后研究人员发现ORMDL3基因与其他几种自身免疫疾病如1型糖尿病(Type Ⅰ Diabetes)和炎症性肠炎(Inflammatory Bowel Disease, IBD)的发病风险相关联。而对该基因的功能研究亦取得许多进展,研究人员发现ORMDL3在内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress, ERS)／未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response, UPR)、炎症反应及脂质代谢等过程中发挥重要作用,而这些机制在AS发病中同样有重要意义。考虑到免疫性疾病常有相似的致病机制或遗传重叠(Genetic Overlap),故有必要尝试研究ORMDL3基因是否与AS风险相关并深入探索其可能的调控手段。在复杂疾病中,通过遗传关联分析寻找到易感基因或位点后,继续功能研究探索主要调控网络是当前的主要挑战之一。自噬(Autophagy,本文讨论的是巨自噬,下面简称自噬)是一种进化保守的分解代谢机制,其通过调控溶酶体降解胞内有形成分以维持细胞稳态并促进细胞生存。在细胞应对外界“恶劣环境”或病理刺激时,自噬过程得以启动并放大。有趣的是,经典的自噬诱导因素即包括ERS/UPR、炎症以及脂质代谢异常等,而这些机制已被证实与ORMDL3基因的功能关系密切,这提示该基因可能参与自噬的调控。现在认为自噬异常在多种疾病中可能扮演关键角色,包括癌症、神经退行性疾病(Neurodegenerative Disease)、微生物感染及AS等。由于自噬调控的复杂性及研究手段的局限性,自噬在AS中的作用目前尚不明确。一般认为自噬具有抗炎、抗氧化应激及抗凋亡等多种功能,故其可抑制AS；但亦有证据表明过度自噬可加速AS的发生发展。因此亟待发现新的自噬相关基因(Autophagy-Associated Gene)以帮助我们揭开自噬现象的神秘面纱并阐明自噬在疾病中的作用。另外很多证据表明精确观测并精密调控自噬,是未来值得期待的疾病诊疗手段。基于上述,我们有理由去探索ORMDL3基因是否可能作为自噬相关基因参与AS过程的调控。此外,AS斑块细胞炎症及凋亡始终是AS研究的重点和热点问题。由于ORMDL3已知功能与炎症及ERS/UPR密切相关,而二者在AS中是凋亡的促进因素,因此亦需深究ORMDL3是否通过调控炎症和凋亡在AS的发病机制中发挥功能。本研究中我们将以血管内皮细胞(Endothelial Cell, EC)作为研究对象,探索)RMDL3基因与AS易感的关系并寻找可能的致病机制。为此我们提出如下问题：第一,ORMDL3基因所在区域的遗传多态位点是否与AS的发病风险存在统计学关联；第二,在AS背景下ORMDL3是否具有调控EC自噬的作用；第三,ORMDL3与EC凋亡和炎症过程有何关系。在本研究中我们将会着力探索上述问题。研究目的1、在中国汉族人群中运用遗传关联分析探讨0RMDL3基因所在区域17q12内两个单核苷酸多态位点(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)与AS易感的关系；同时,探究AS病例与健康对照外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC) ORMDL3基因表达的差异；此外,探明上述SNP不同基因型与PBMC ORMDL3基因表达的关系。2、探究氧化低密度脂蛋白(Oxidized Low-Density Lipoprotein, ox-LDL)能否调控ORMDL3基因表达并诱导EC自噬；在ox-LDL刺激下沉默ORMDL3基因的表达,以明确该基因在ox-LDL诱导的EC自噬中的作用及可能机制。另外尝试验证ORMDL3在EC基础自噬和饥饿诱导自噬中的作用。3、同上,在ox-LDL刺激EC并干扰ORMDL3基因表达的基础上,探明该基因在ox-LDL诱导的EC凋亡和炎症中的角色。研究材料和方法1、在遗传关联分析中纳入来自中国汉族人群的CAD病例和健康对照,收集样本PBMC并提取DNA后,对两个SNP位点rs7216389与rs9303277进行基因分型并做统计处理,以确定基因型与CAD发病是否存在统计学关联；同时提取样本PBMC总RNA和蛋白后,以实时定量及免疫印迹技术检测ORMDL3基因mJRNA水平和蛋白水平的表达情况,分析CAD病例与对照之间基因表达是否有差异；另外在1nRNA水平上明确上述SNP位点不同基因型携带者之间基因表达是否有差异。2、选取人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC)和人主动脉血管内皮细胞(Human Aortic Endothelial Cell, HAEC)作为研究对象,以实时定量及免疫印迹检测ORMDL3基因mRNA和蛋白表达情况,以免疫印迹检测自噬标志物MAPLC3B、SQSTM1/P62及BECN1蛋白水平,以免疫荧光检测LC3焦点形成。在ox-LDL刺激HUVEC和HAEC的基础上,明确ox-LDL能否影响ORMDL3基因表达,并利用短发卡RNA(Short Hairpin RNA, shRNA)沉默ORMDL3基因,以阐明ORMDL3在ox-LDL诱导的EC自噬中的作用。此外明确ORMDL3在EC基础自噬和血清饥饿诱导的自噬中的作用。3、选取HUVEC为研究对象,以免疫印迹检测凋亡标志物Cleaved Caspase 3和Cleaved PARP蛋白水平,以流式细胞术检测凋亡细胞比例,以CCK-8试验检测细胞活性,以实时定量技术检测炎症因子TNF (Tumor Necrosis Factor)、 IL(Interleukin)-6及IL-17A等炎症因子mRNA表达水平。在ox-LDL刺激HUVEC和shRNA干扰ORMDL3表达的基础上,探索ORMDL3在ox-LDL诱导EC凋亡和炎症中的作用。研究结果第一部分ORMDL3基因与中国汉族人群动脉粥样硬化易感的遗传关联分析在本部分中,为研究中国汉族人群ORMDL3基因所在区域内SNP位点rs7216389和rs9303277与AS发病风险是否存在关联,在以病例-对照设计为核心的遗传关联分析中,我们共纳入来自中国北方汉族人群和中国南方汉族人群的CAD病例1829例及健康对照1806例。在年龄及性别方面,CAD病例组及对照组未见差异。病例组身体质量指数(Body Mass Index, BMI)、吸烟者比例、血甘油三酯、总胆固醇及LDL水平显著高于对照组；病例组HDL水平显著低于对照组。在上述两个研究人群的病例和对照组中,两个SNP位点的分型结果未偏离哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE) (P0.05)。在中国北方汉族人群中,CAD病例组rs7216389 T等位基因与rs9303277 C等位基因频率显著高于对照组(rs7216389:71.77% vs.67.07%; rs9303277:68.50% vs.64.66%)。在校正年龄、性别、BMI、血脂指标及吸烟等因素之后,rs7216389与rs9303277位点与CAD患病风险显著相关(rs7216389:P=0.003; rs9303277: P=0.017)。携带rs7216389 T等位基因或rs9303277 C等位基因的个体表现出更高的CAD患病风险(rs7216389:odds ratio [OR] 0.80,95% confidence interval [CI] 0.69-0.93; rs9303277:OR 0.84,95% CI 0.73-0.97).同样在中国南方汉族人群中,我们发现CAD病例组rs7216389 T等位基因与rs9303277 C等位基因频率亦显著高于对照组(rs7216389:75.22% vs.71.38%; rs9303277:75.72% vs.72.28%)。校正上述协变量之后,rs7216389与rs9303277位点仍与CAD患病风险显著相关(rs7216389:P=0.009; rs9303277:P=0.022)。携带rs7216389 T等位基因或rs9303277 C等位基因的个体罹患CAD风险更高Crs7216389:OR 0.82,95% CI 0.71-0.95; rs9303277:OR 0.84,95% CI 0.72-0.97)。之后,为探讨上述ORMDL3基因SNP位点与基因表达的关系,首先我们提取89例患者的PBMC总RNA后以实时定量检测ORMDL3基因mRNA水平,结果发现携带上述两个SNP风险等位基因的个体ORMDL3基因nRNA表达水平显著高于参考等位基因(Reference Allele)纯合子携带者(rs7216389,P=0.012; rs9303277, P=0.004)。之后我们检测并比较37例病例与37例对照PBMC ORMDL3基因mRNA水平,发现病例ORMDL3基因mRNA表达显著高于对照(P=0.003)；而以免疫印迹检测4例病例与4例对照PBMC ORMDL3基因蛋白表达亦得出一致结论(P=0.034)。第二部分ORMDL3在动脉粥样硬化中对内皮细胞自噬的调控以ox-LDL刺激HUVEC和HAEC,我们发现ox-LDL可以时间依赖(100μg/ml,处理0、4、8和12h)与剂量依赖(0、50和100μg/ml,处理12h)地上调ORMDL3基因nRNA和蛋白水平的表达。之后我们研究了ox-LDL诱导EC自噬过程的细节,发现在HUVEC和HAEC中,ox-LDL可以时间依赖(100μg/ml,处理0、4、8和12h)与剂量依赖(0、50和100μg/ml,处理12h)地上调自噬标志物LC3B-Ⅱ蛋白表达水平；ox-LDL可以促进SQSTM1/P62的累积；同时免疫荧光示ox-LDL刺激促进HUVEC LC3焦点的形成；而ox-LDL与氯喹(50μM)共同刺激HUVEC可进一步加强LC3B-II和SQSTM1/P62蛋白累积。上述结果证明了ox-LDL可促进EC自噬过程。为研究ORMDL3是否调控EC自噬,我们利用shRNA干扰HUVEC ORMDL3表达,结果证实基因干扰效率较高。干扰ORMDL3可以导致HUVEC细胞本底自噬水平降低；另外干扰ORMDL3可抑制ox-LDL诱导的自噬强度。另外我们发现血清饥饿6h处理可引起HUVEC细胞较高的自噬水平,而干扰ORMDL3还可降低血清饥饿(6h)诱导的自噬水平(即都表现为LC3B-Ⅱ转化减少及SQSTM1/P62累积增多)。上述结果表明AS中,ORMDL3在异常脂质代谢诱导的EC自噬中可能发挥重要作用；其也同样可能与EC基础自噬和饥饿诱导的自噬有关。BECN1是重要的自噬正调控分子之一。我们发现干扰ORMDL3不仅可抑制ox-LDL诱导的BECN1蛋白表达,还可下调细胞本底和饥饿诱导的BECN1蛋白表达,这说明ORMDL3可能通过BECN1调控自噬。另外我们发现干扰ORMDL3并不能引起HUVEC p-mTOR/mTOR及p-AMPK/AMPK比值的变化。综上所述,在ox-LDL介导的EC自噬中,可能存在ox-LDL-ORMDL3-BECN1-自噬的调控方式；而ORMDL3可能在生理性或病理性自噬反应中都发挥重要作用。第三部分ORMDL3在动脉粥样硬化中对内皮细胞凋亡和炎症的影响ox-LDL是一种强凋亡诱导剂,我们发现ox-LDL处理(100μg/ml,处理12h)可诱导HUVEC凋亡发生,表现为凋亡标志物Cleaved PARP与Cleaved Caspase3蛋白表达上调。而在基础水平上,沉默ORMDL3后HUVEC Cleaved PARP与Cleaved Caspase 3蛋白表达同样上调。之后我们发现与对照相比,干扰ORMDL3后HUVEC对ox-LDL的促凋亡毒性更为敏感,表现为Cleaved PARP与Cleaved Caspase 3蛋白表达进一步上调,CCK-8试验示细胞活力进一步减低,而流式细胞术示凋亡细胞比例明显增多。此外ox-LDL可有效促进EC炎症反应,我们发现沉默ORMDL3可部分逆转ox-LDL诱导的TNF和IL-17AmRNA表达,而IL-6表达未见改变。上述这些结果提示ORMDL3可能作为凋亡和炎症调控因子参与AS发生发展。研究结论1、ORMDL3基因所在17q12区域2个SNP位点rs7216389和rs9303277与中国汉族人群AS易感及ORMDL3基因表达相关联。此外该基因在CAD患者中表达显著高于对照。这些结果提示在中国汉族人群中ORMDL3基因可能是AS的一个易感基因。2、ORMDL3不仅参与调控ox-LDL诱导的EC自噬,也在EC基础自噬和饥饿诱导自噬中发挥作用。这说明ORMDL3可能是一个重要的自噬相关基因,其调控自噬的详细机制目前尚不明确。3、ORMDL3可能具有抗凋亡的功能,但是关于ORMDL3如何影响凋亡及其与自噬的关系仍存诸多疑问。此外ORMDL3可能在AS炎症反应中发挥作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5
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本文编号：2375804