【摘要】：研究背景:随着科技水平的日益发展,先天性心脏病的诊断和治疗水平也大幅度提高。但是复杂性先天性心脏病仍然是一个难题,死亡率居高不下。其中最常见的就是紫绀型先天性心脏病。慢性缺氧是紫绀型先天性心脏病的共同的病理生理基础,缺氧心肌细胞是如何完成从细胞信号传导、蛋白合成到代谢的转变,维持心肌细胞慢性缺氧代偿性适应,具体机制未完全研究清楚。因此,研究慢性缺氧条件下心肌细胞的适应机制可能对于紫绀型先天性心脏病的治疗和预后有所帮助。miR-17-92基因簇为一种典型的含有多顺反子启动子的高度保守的基因簇,位于人染色体13q31.3处,C13orf25基因第3个内含子区,其转录前体包含了 6个串联的茎环发卡结构,最终可产生 miR-17,miR-18,miR-19a,miR-20,miR-19b 和 miR-92 等6个成熟的miRNA。miR-17-92基因簇在肿瘤发生和肺、心脏、免疫器官的正常发育过程中都起着至关重要的作用。miR-17-5p属于miR-17-92基因簇,定位于人染色体13q31,是一种编码6个miRNA的多顺反子性的miRNA。有研究发现,miR-17-5p通过STAT3信号通路来调控骨髓抑制细胞生长(MDSC)。最新研究发现,在心肌缺血再灌注小鼠模型和体外由H202诱导的氧化应激小鼠心肌细胞模型中,miR-17-5p表达增高,并且通过和STAT3的3'UTR结合,降低STAT3的表达,从而促进心肌细胞的凋亡。许多研究显示,IL-6-JAK-STAT3信号通路在心脏病理、生理方面具有保护的作用。之前我们的研究显示,在心肌慢性缺氧过程中,NF-κB信号通路与SOCS3(STAT3自身诱导调节因子)所调控的IL-6/JAK2/STAT3信号通路的交互关系也影响着心肌传导通路和心肌细胞的衰亡。因此,本实验主要探讨心肌慢性缺氧环境下,miR-17-5p和STAT3的表达变化以及miR-17-5p对STAT3的调控对于缺氧心肌细胞凋亡的影响。研究目的:本实验拟在临床心肌标本和H9c2心肌细胞两个水平检测慢性缺氧条件下miR-17-5p的表达变化。在H9c2心肌细胞慢性缺氧模型中使用抑制剂和增强剂改变miR-17-5p的表达,检测改变miR-17-5p表达对STAT3及其下游靶基因c-myc的影响,从而对缺氧H9c2心肌细胞的影响。研究方法:1.研究临床心肌标本和H9c2心肌细胞两个水平缺氧对miR-17-5p表达影响。1.1收集人心肌标本,紫绀组病人患有法洛四联症,非紫绀组病人患有右室流出道狭窄合并室间隔缺损,标本于手术中取自右室流出道。提取组织RNA,采用RT-PCR检测miR-17-5p在两组病人标本中的表达情况。1.2将同一批次H9c2(大鼠心室肌细胞系)细胞置于低氧培养箱(1.0%O2、5.0%C02)中分别培养0h、12h、24h、48h及72h,对照组置于普通培养箱(21.0%O2)中培养,利用RT-PCR技术检测在心肌细胞系中随着缺氧时间的延长miR-17-5p表达情况。2.研究miR-17-5p在H9c2细胞慢性缺氧中的作用及对STAT3信号通路的调控机制:2.1常氧时在H9c2细胞系中转染带绿色荧光的阴性对照,通过荧光显微镜观测转染效率。2.2 向 H9c2 细胞分别转染 agomir、antagomir 和 NC,建立 agomir 组、antagomir组、对照组和空白组。2.3将转染后的心肌细胞及空白组常氧培养24 h后(n=4),再缺氧培养48 h,通过TUNEL检测法检测各组心肌细胞的凋亡情况。2.4 CCK8试剂检测缺氧0h、12h、24h、48 h各组心肌细胞的增殖情况。2.5 TUNEL实验检测缺氧48h后各组心肌细胞的凋亡情况。2.6 Western Blot检测缺氧48h后各组心肌细胞内STAT3、p-Tyr-705-STAT3及其下游调控蛋白c-myc蛋白含量。研究结果:1.与非紫绀组(0.482±0.163)相比,紫绀组(1.45±0.705)患儿心肌组织中miR-17-5p表达明显升高(P0.01)。2.在慢性缺氧中培养H9c2心肌细胞,RT-PCR结果显示慢性缺氧0h(0.933±0.115)、12h(1.802±0.130)、24h(1.973±0.140)、48h(2.030±0.134)及 72h(2.113±0.220)时 H9c2 细胞miR-17-5p表达逐渐增高(P0.01)。3.将antagomir荧光阴性对照转染H9c2细胞,荧光显微镜观测结果显示转染效率达到75%以上。4.CCK8实验检测结果显示,缺氧Oh,6h,24h,48h后,和对照组相比,上调组大鼠H9c2心肌细胞增殖明显减少(P0.01),而下调组、空白组则无明显差异(P0.05)5.TUNEL实验检测结果显示,缺氧48h后,和对照组(0.1063±0.010969)相比,上调组(0.1599±0.02016)大鼠H9c2心肌细胞明显凋亡增加(P0.01),而下调组(0.0941±0.01913)、空白组(0.0948±0.013286)则无明显差异(P0.05)6.miR-17-5p过表达的大鼠H9c2心肌细胞缺氧48h后,与对照组及空白组相比,STAT3,p-Tyr-705-STAT3 及其下游调控蛋白 c-myc 的表达下降(P0.01);而 miR-17-5p抑制的大鼠H9c2心肌细胞缺氧48h后,与对照组及空白组相比,STATT3,p-Tyr-705-STAT3及其下游调控蛋白c-myc的表达无明显改变(P0.05)。结论:1.与非紫绀型患者相比,紫绀型患者心肌标本中miR-17-5p升高3倍左右。2.H9c2心肌细胞慢性缺氧时,细胞中miR-17-5p表达逐渐升高。3.H9c2心肌细胞慢性缺氧时,miR-17-5p过高表达对于STAT3信号通路有明显的抑制作用,促进心肌凋亡,减少增生。miR-17-5p的抑制对于STAT3信号通路无明显的改变,对心肌凋亡和心肌增生无明显影响。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.2
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本文编号：
2382813
