microRNA-449c-5p调控主动脉瓣退行性钙化作用机制的研究

发布时间：2018-12-27 14:15

【摘要】：研究背景及目的：随着我国风湿热发病率下降及老龄化加剧,退行性钙化性主动脉瓣膜病(DCAVD)成为老年人最常见的心脏瓣膜病。目前DCAVD已成为我国老年人心衰、晕厥甚至猝死的主要病因之一,尚无有效药物能预防或延缓其进展,手术仍是最有效的治疗手段,这给患者家庭及社会带来了巨大经济负担。探讨DCAVD发病机制,从而及时有效的干预其进展,将具有极大的经济价值和社会价值。既往认为DCAVD是退行性钙磷沉积不可逆的被动过程,近年来研究表明DCAVD是类似成骨样分化受多因素调控的主动过程,涉及慢性炎症反应、脂代谢异常及钙盐沉积等。至今,DCAVD发病机制仍不清楚,有待进一步研究。Mohler等已分离出瓣膜间质细胞(VICs),并证实其在特定条件下可转化为成骨细胞样细胞,并形成钙结节。研究证实主动脉钙化瓣膜中成骨细胞和骨组织的标志物表达升高,如碱性磷酸酶、骨钙蛋白、骨桥蛋白等,提示钙化相关因子可能参与DCAVD发病过程,VICs向成骨细胞分化可能是DCAVD发病的重要基础。microRNAs是细胞内重要的非编码调控分子,可参与调控多种生理和病理过程。VICs结合miRNA是研究DCAVD发病机制的一个新视角,存在为DCAVD提供早期诊断及治疗的潜在价值。本研究采用niRNA芯片技术筛选出调控DCAVD相关的miRNAs,从中选取miRNA-449c-5p作为研究对象,进一步验证其功能,通过RT-PCR、Western blot等技术探讨其调控机制,以期阐明DCAVD发病机制,寻找其早期诊断及干预措施。感染性心内膜炎(IE)是指心脏内膜微生物感染,可伴赘生物形成,近年来发病率呈上升趋势。关于活动期IE手术时机及效果的选择目前仍存在争议,传统上多倾向于内科治疗,即手术多在正规有效抗感染4-6周,体温正常,血培养阴性后进行,但在此期间,易发生心功能不全、栓塞等,病死率较高。本研究拟通过分析活动期IE血培养及药敏结果,为合理选择抗生素提供依据,并进行长期随访,以探讨早期手术疗效。研究方法：第一部分1、差异miRNAs筛选及目标miRNA确定：对瓣膜钙化组织和相对正常组织提取RNA,通过miRNA芯片技术测定miRNA表达情况,筛选出差异miRNAs,从差异miRNAs中选取miRNA-449c-5p作为研究对象,通过RT-PCR技术验证其差异表达。2、VICs培养和鉴定：术中留取人正常主动脉瓣膜,采用改进的胶原酶消化法获取VICs,并对VICs进行细胞表型鉴定。3、差异性表达1niRNA-449c-5p的功能验证:将miRNA-449c-5p mimics、inhibitor和negative control分别导入VICs,模拟过表达和低表达miRNA-449c-5p,进行转染效率测定,然后进行成骨诱导,在7天和14天进行RT-PCR、Western blot、ALP活性测定及茜素红染色,验证miRNA-449c-5p对VICs成骨分化的影响。4、miRNA-449c-5p调控VICs成骨分化的机制：通过miRNA专业靶基因预测网站,初步预测miRNA-449c-5p靶基因,再通过双荧光素酶实验,验证两者结构匹配程度,最后通过SiRNA技术验证靶基因的真实性。5、VICs成骨诱导中,IL-6对miRNA-449c-5p的调控作用：首先,收集VICs成骨诱导前和诱导后24h、48h的培养基,检测其IL-6浓度；其次,VICs培养基中,加入IL-6对其刺激,分别于加入前和加入后24h、48h收集细胞,行miRNA-449c-5p测定。6、动物实验：将miRNA-449c-5p agomirs、antagomirs及negative control分别经尾静脉注射入Balb/c小鼠体内,分别过表达和低表达miRNA-449c-5p,然后皮下注射Vitamin D3诱导软组织钙化,6周后行心脏超声检测。第二部分回顾性分析2010年5月至2014年7月我院收治的62例活动期IE患者血培养结果及临床资料,所有患者均早期外科治疗,术后长期随访。研究结果：1、成功筛选出DCAVD相关的差异miRNAs,并从中选取miRNA-449c-5p作为研究对象；2、成功分离出VICs,并对其表型进行了鉴定,证实其达到体外实验要求；3、对miRNA-449c-5p进行功能研究,动物水平、细胞水平、蛋白水平和mRNA水平研究显示,miRNA-449c-5p能够调控VICs成骨分化；4、通过靶基因专业预测网站,预测miRNA-449c-5p靶基因为Smad4,通过双荧光素酶报告实验,确定Smad4为其靶基因,最终确定miRNA-449c-5p通过TGF-β/Smad通路调控VICs成骨分化；5、证实VICs成骨分化中,分泌型IL-6表达上调,而IL-6刺激VICs可导致其miRNA-449c-5p表达下调,从而证实DCAVD发病中IL-6可能调控miRNA-449c-5p的表达；6、活动期IE主要病原菌为链球菌、粪肠球菌和金葡菌,围术期死亡2例,余60例治愈出院,57例术后长期随访心功能Ⅰ级42例,Ⅱ级15例,随访期均无IE复发。结论：1、筛选出DCAVD特异性miRNA表达谱；2、miRNA-449c-5p靶基因为Smad4,通过TGF-β/Smad信号通路在体内外水平调控VICs成骨分化；3、IE病原菌以革兰氏阳性菌为主,需根据药敏结果合理选择抗生素,早期手术治疗活动期IE临床疗效满意。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.5

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本文编号：2393193