重组噬菌体靶向探针在动脉血栓近红外活体成像中的应用

发布时间：2019-03-05 20:51

【摘要】：研究目的：血栓性疾病是临床常见病,严重危害着人类的健康及生命。血管一旦形成血栓,便可使累及的血管狭窄甚至闭塞,造成相应的器官或者组织缺血而致功能障碍、器官或者组织坏死,往往造成不可逆转的严重后果,甚至是死亡。血栓形成是中国前三位的致死性心血管病——心脏病、脑卒中和静脉血栓栓塞症(VTE)的共同发病机制。尤其是肺血栓栓塞症致死率高,临床症状多样,缺乏特异性,临床上漏诊与误诊情况严重,及时、准确进行诊断至关重要。目前用于诊断血栓的检测方法非常多,但是超声、CT、MRI、DSA、SPECT等检测方法都有各自的缺陷。因此寻找一种经济的、敏感的手段变得十分迫切。前期研究表明,P1Cm(专利号ZL 201110341296.X,结缔组织生长因子小肽)能够靶向结合血小板表面高表达蛋白αIIbp3,我们试图用噬菌体展示技术将P1Cm肽展示在噬菌体表面,以噬菌体作为纳米载体制备近红外探针用于血栓的靶向成像研究。第一部分噬菌体展示载体的构建及重组噬菌体的制备方法：利用噬菌体展示技术,通过基因工程方法对野生噬菌体M13进行突变,将目的肽片段插入其中构建出重组噬菌体,获得重组噬菌体；通过ELISA、PCR,及基因测序等方法验证构建是否成功；同时,用CCK8细胞毒性实验考察重组噬菌体的细胞毒性。结果：通过ELISA、Q-PCR,酶切鉴定、基因测序等方法验证我们成功构建了重组噬菌体载体,并引入Kpn Ⅰ和Eag Ⅰ酶切位点；通过PEG8000/NaCl沉淀法获得了高纯度重组噬菌体；细胞毒性实验表明,重组噬菌体对细胞存活率几乎没有影响。结论：通过噬菌体展示技术成功构建了能展示任意已知肽的噬菌体载体,并通过转化及感染获得目的重组噬菌体,该噬菌体无明显细胞毒作用。第二部分重组噬菌体与血小板体外结合研究方法：用FITC及CY5.5标记重组噬菌体,纯化后得到荧光探针,评估其稳定性；用CCK8实验考察荧光探针的细胞毒性；将荧光探针分别与血小板共孵育,用流式细胞术和激光共聚焦显微镜考察荧光探针与血小板的结合。结果：标记后的重组噬菌体在4周时间里稳定性较好；噬菌体荧光探针对细胞存活率没有明显影响；流式细胞术及激光共聚焦显微镜结果显示,重组噬菌体荧光探针能够通过膜表面糖蛋白αⅡbβ3中的β3亚基与血小板特异性结合,且荧光强度大于荧光素标记的P1Cm肽。结论：成功制备了基于重组噬菌体的靶向纳米探针,该探针能与血小板表面的β3亚基特异性结合。第三部分重组噬菌体纳米探针用于动物动脉血栓靶向成像的研究方法：利用三氯化铁诱导建立裸鼠颈动脉血栓模型,并将荧光探针经尾静脉注射入动物体内,利用小动物活体成像系统对血栓部位进行近红外成像；成像结束离体重要脏器进行近红外成像。将离体的颈动脉进行HE染色进行病理学检测,并制作颈动脉、心脏、肝脏、肾脏切片与探针杂交,在激光共聚焦显微镜下观察。结果：用三氯化铁可以成功诱导裸鼠颈动脉血栓模型；将CY5.5-M13-P1Cm与CY5.5-P1Cm荧光探针经尾静脉注射入小动物体内后,发现两者均能够对血栓部位进行成像,并且CY5.5-M13-P1Cm探针成像效果优于CY5.5-P1Cm;同时,CY5.5-M13-P1Cm探针成像时间更久、更稳定。荧光杂交试验结果显示,CY5.5-M13-P1Cm及CY5.5-P1Cm探针均可与血栓特异性结合,但CY5.5-M13-P1Cm探针的荧光信号强度及分布大于CY5.5-P1Cm探针,与在体实验结果一致。结论：重组噬菌体CY5.5-M13-P1Cm近红外荧光探针能够靶向血栓成像,持续时间及荧光强度大于单分子标记的CY5.5-P1Cm探针,为重组噬菌体作为纳米靶向载体的深入研究打下理论和实验基础。
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【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

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