【摘要】：一、研究背景近年来,经皮冠状动脉介入治疗(PCI)已经广泛的用于治疗血管壁粥样硬化引起的冠状动脉狭窄。然而,有相当一部分患者术后发生病变处血管的再狭窄,从而降低了PCI的疗效,并且增加再发心血管事件的风险。目前认为损伤血管修复过程中,新生内膜的异常增生是发生PCI术后再狭窄的病理生理基础。而血管平滑肌细胞的增殖和迁移能力的增强,是血管损伤后新生内膜增生,从而导致管腔狭窄的重要原因。而血管平滑肌细胞具有显著的表观可塑性,使其可快速适应周围环境的改变。当受到细胞外基质成分、细胞因子、剪切力、氧自由基等因素的刺激后,血管平滑肌细胞会显著降低血管平滑肌细胞分化标志物的表达,提高增殖,迁移和合成的细胞外基质的能力,以参与新生内膜的形成。血管平滑肌细胞表型的开关在血管疾病中发挥重要的作用,因此,认识血管平滑肌细胞表型转化的分子机制,有可能为防治PCI术后再狭窄提供调控的靶点。OCT4由Pou5fl基因编码产生,主要定位于细胞核,其在胚胎干细胞及间充质干细胞等未/低分化细胞高表达,而在高度分化的成体细胞正常情况下则几乎不表达。近年来,随着对OCT4研究的深入,发现OCT4除了在干细胞和生殖细胞肿瘤中高表达以外,还在非生殖系统的肿瘤细胞中同样有表达。不仅如此,OCT4甚至在成体细胞和异位的子宫内膜组织中再表达,并且使肿瘤细胞和成体细胞表现出易于迁移和增殖的表型。这些研究结果提示,OCT4极可能在某些病理状态下被激活,从而在细胞去分化的过程中起到重要的作用,并使得细胞表现出更容易增殖、迁移等具有去分化表型的能力。目前,在心血管疾病的发病机制研究中,关于OCT4的作用鲜有报道。本课题旨在通过在体外和体内实验,观察OCT4对细胞增殖和迁移的调节作用,以及对下游靶基因的调控机制。二、研究目的1、刺激人主动脉平滑肌细胞,检测OCT4的表达,并通过过表达和抑制的方法观察OCT4对血管平滑肌细胞增殖迁移的影响;2、在小鼠颈动脉损伤模型上观察OCT4对血管新生内膜增殖的调节；3、用生物学方法检测与OCT4可能相互作用的靶基因,明确其对血管平滑肌细胞功能的调控作用。三、研究方法(一)第一部分用肿瘤坏死因子-α,白介素-1-β,血小板衍生生长因子-BB,转化生长因子-p刺激人主动脉平滑肌细胞,用定量PCR和western blot的方法检测OCT4的表达情况。在血管平滑肌细胞中过表达和抑制OCT4,用CCK-8、平板划线,transwell实验的方法检测OCT4在血管平滑肌细胞增殖和迁移中的作用。(二)第二部分建立小鼠颈总动脉损伤模型,小鼠随机分为以下几组：1、颈动脉损伤组；2、颈动脉损伤+OCT4腺病毒转染组；3、颈动脉损伤+GFP腺病毒转染组；4、颈动脉损伤+siRNAocT4转染组；5、颈动脉损伤+siRNACTRL转染组,对侧血管作为Sham对照。分别在损伤后3天,7天,14天处死老鼠,做组织切片HE染色,免疫组化,定量PCR等,并测量小鼠内膜和中膜的面积,计算内膜／中膜比值。在小鼠损伤血管中,对OCT4的表达做定位和定量分析。在小鼠损伤血管过表达和抑制OCT4的表达,用组织切片HE染色,定量PCR等实验方法,检测OCT4在血管新生内膜形成中的作用。(三)第三部分在血管平滑肌细胞中过表达OCT4,用定量PCR的方法用筛选在血管平滑肌细胞中可能受到OCT4调控的靶基因。选择下游基因进行细胞功能测试。四、研究结果(一)第一部分血管平滑肌细胞中OCT4的mRNA水平在白介素-1-β,肿瘤坏死因子-α,PDGF-BB,转化生长因子-p刺激下,发生不同程度的改变。PDGF-BB刺激血管平滑肌细胞,诱导OCT4表达呈时间和剂量依赖性。在血管平滑肌细胞过表达OCT4,平板划线和transwell实验结果提示转染Ad-OCT4的血管平滑肌细胞迁移数量较转染Ad-GFP的细胞多,CCK-8结果提示转染Ad-OCT4的血管平滑肌细胞增殖的数量较转染Ad-GFP的细胞多。siRNA转染PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞,转染siRNAOCT4的血管平滑肌细胞迁移数量较转染siRNACTRL时细胞少,CCK-8结果提示转染siRNAOCT4的血管平滑肌细胞增殖的数量较转染siRNACTRL的细胞少。(二)第二部分1、在小鼠颈动脉损伤后14天的颈动脉横切片上,经免疫荧光双标染色显示OCT4表达在新生内膜血管平滑肌细胞中,且为核表达。OCT4特异性抗体对组织切片进行免疫组化染色显示OCT4在损伤后第7天在新生内膜有表达,14天在内膜的表达较第7天显著增加,提示OCT4的表达随损伤时间而增多。损伤血管的OCT4的mRNA水平较未损伤的对照组升高(P0.05)。2、转染Ad-OCT4腺病毒组,损伤的小鼠颈动脉血管内膜面积(32.45±1.82)×103μm2明显大于感染Ad-GFP腺病毒组(21.48±0.75)×103μm2 (P0.05)。转染Ad-OCT4腺病毒组新生内膜/中膜的比值(1.03±0.07)明显大于感染Ad-GFP腺病毒组(0.74±0.06;P0.05)。3、未损伤组的小鼠血管内弹力板完整,管壁光滑,无内膜增生;siRNA oCT4或者siRNACTRL。siRNACTRL转染损伤的小鼠颈动脉组可见中膜内排列紊乱的平滑肌细胞,血管平滑肌细胞的细胞核明显增大变圆,损伤血管内膜可见弥漫性增厚,伴有明显管腔的缩小。而转染siRNAOCT4组尽管也可见中膜平滑肌细胞排列紊乱,但损伤血管内膜弥漫性增厚的程度较前者较轻,且管腔的缩小明显较轻。血管内膜面积(4.95±1.54)×103μm2明显小于siRNAcTRL组(23.53±2.18)×103μm2(P0.05)。新生内膜/中膜比值也明显小于siRNACTRL组(0.19±0.06 VS 0.89±0.14; P0.05)。(三)第三部分1、在过表达OCT4的血管平滑肌细胞中,表达升高达到统计学差异的基因有：Sox2, Nanog, BMP4, Etv5, Etv1, Foxd3, KLF4, KLF5, Gadd45a, MMP2, MMP9;表达下降达到统计学差异的基因有：TCF3, Vegfc, DUSP27, Tns3, Psme4。2、MMP2在过表达OCT4的血管平滑肌细胞细胞中,RNA水平和蛋白水平均显著升高。siRNAMMP2转染组血管平滑肌细胞的增殖较对照组降低但未达到统计学差异,转染了siRNAMMP2以后,穿过划线的平滑肌细胞较对照组的数量显著降低,穿过小室的平滑肌细胞也较对照组的数量显著降低。五、结论1.不同刺激因子使血管平滑肌细胞的OCT4的表达发生变化。OCT4促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移。抑制OCT4表达可以抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移。2.OCT4在小鼠颈动脉损伤模型中升高,主要在新生内膜的血管平滑肌细胞中表达。过表达OCT4促进小鼠颈动脉损伤的新生内膜的增生。下调OCT4抑制小鼠颈动脉损伤的新生内膜的增生。3.OCT4调控血管平滑肌细胞,是通过对一些基因的调节。MMP2作为OCT4的下游基因,参与了OCT4调控的血管平滑肌细胞的迁移,可能影响细胞增殖。4.OCT4可能作为冠心病,支架植入术后再狭窄等血管增殖性疾病新的治疗方向,为临床的应用提供的新的思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
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2439803
