热休克蛋白27对同型半胱氨酸诱导的内皮细胞损伤的作用及机制

发布时间：2019-03-16 09:04

【摘要】：研究背景：动脉粥样硬化是由免疫调控和脂质代谢异常共同作用引起的一种慢性炎症性疾病,是冠心病的主要病理基础。血管内皮是介于循环血压与血管平滑肌之间的生理屏障,内皮细胞在不同刺激作用下,通过分泌多种血管活性因子来平衡血管的舒张和收缩,同时维持血管稳态。当内皮细胞受损时,舒缩平衡被打破,出现功能障碍,破坏血稳态,导致白细胞和血小板黏附誊血栓形成、平滑肌细胞增殖、脂质积累和血管痉挛,并最终形成粥样斑块。内皮功能障碍是动脉粥样硬化发生过程中的主要早期事件,并参与粥样斑块的进展和并发症的发生。因而早期预防和控制内皮功能障碍是防治冠心病的关键。高同型半胱氨酸血症是公认的动脉粥样硬化发生和发展的一个独立危险因素。血浆同型半胱氨酸(homocysteine, Hey)升高会损伤内皮细胞功能,导致内皮依赖的血管舒张功能异常,内皮细胞抗血栓作用丧失,引起脂质过氧化,血小板黏附聚集等一系列病理过程,进而引发早期动脉粥样硬化。热休克蛋白27(heat shock protein 27, HSP27)是小热休克蛋白(small heat shock proteins, sHSPs)家族中的一员,参与多种细胞过程,如细胞凋亡、炎症、细胞迁移和动脉壁的稳态维持。研究发现HSP27在抗心肌凋亡、抗缺血损伤、抗炎性反应中都有积极的作用,对平滑肌细胞的增殖迁移有调控作用。近年来研究发现HSP27在动脉粥样硬化的发展中起重要作用,血清HSP27水平与动脉粥样硬化程度呈负相关。目前认为,HSP27可能通过维持血管稳态、抗凋亡、稳定细胞骨架、抑制单核/巨噬细胞介导的细胞受损、稳定纤维蛋白血凝块等发挥抗动脉粥样硬化作用。HSP27可能成为动脉粥样硬化的潜在生物学标志,作为预防和诊疗动脉粥样硬化的新靶点。第一部分同型半胱氨酸损伤内皮细胞的机制目的：血浆Hcy升高可导致内皮功能障碍,是动脉粥样硬化的发病机制中的早期事件。研究表明Hcy能激活线粒体途径,诱导血管内皮细胞凋亡。死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase, DAPK)是一种已知的凋亡调节基因,可被各种刺激因素激活,是凋亡信号的汇合点。已证实DAPK参与剪切应力诱导的内皮细胞凋亡过程。本实验拟通过体外细胞实验观察Hcy诱导的内皮细胞凋亡,并探讨DAPK在其中的调控作用。方法：1.MTT法检测Hcy对HUVECs细胞生存率的影响；Hoechst33342核染色；AnnexinV-PI双染及流式细胞术检测细胞凋亡率。2. qRT-PCR和 Western blot检测Hcy作用下HUVECs中DAP K表达变化。3.转染DAPK siRNA抑制HUVECs中DAPK的表达,并应用、Western blot检验表达变化；4.流式细胞术检测DAPK对细胞凋亡率的影响；流式细胞术检测DAPK对线粒体膜电势的影响；5. Western blot检测线粒体凋亡途径相关蛋白Bax、Bcl-2？ caspase-3及PARP的变化。结果：1.Hcy能降低UVECs的细胞生存率并诱导其凋亡,并呈浓度依赖性;2.Hcy能上调HUVECs中DAPK的表达,并呈浓度依赖；3.转染DAPK siRNA能明显下调HUVECs中 DAPK的表达；4.下调DAPK表达能抑制Hcy诱导的细胞凋亡；5.下调DAPK表达能改善线粒体膜电势,增加Bcl-2蛋白的表达,降低Bax表达,减少caspase-3和PARP裂解。第二部分HSP27对Hcy诱导的内皮细胞损伤的保护作用及其机制目的：血浆Hcy升高可导致内皮功能障碍,被认为是动脉粥样硬化的独立危险因素。HSP27是sHSPs家族的重要成员,近来研究报道HSP27有抗动脉粥样硬化作用。本实验旨在探讨HSP27在Hcy引起的内皮细胞损伤中的保护作用及相关机制。方法：1. Western blot检测Hcy作用下HUVECs中HSP27基因表达变化；2.构建高表达HSP27的HUVECs细胞系,应用荧光显微镜、qRT-PCR和Western blot鉴定HSP27高表达效果；3.亚硝酸还原法检测细胞培养液中NO水平的变化；qRT-PC R检测内皮细胞相关细胞因子的r iRNA表达变化；4. AnnexinV-PI染色及流式细胞术检测高表达HSP27对细胞凋亡的影响；5. Western blot检测高表达HSP27对Hcy处理的HUVECs中DAPK表达的影响；6.流式细胞术检测高表达HSP27对ROS水平和线粒体膜电势的影响；7. Western b lot检测高表达HSP27对线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2、 Bax、caspase-3及 PARP表达的影响。结果：1.Hcy上调HUVECs中 HSP27的表达,并呈剂量依赖性。2.高表达HSP27的HUVECs细胞系能稳定高表达HSP27。3. HSP27能减弱Hcy对内皮细胞表达NO和细胞因子的影响。4.HSP27能抑制Hcy引起的内皮细胞凋亡。5.高表达HSP27不影响DAPK的表达变化。6.HSP27能减弱Hcy诱导的ROS产生和MMP丧失。7.HSP27能促进Bcl-2蛋白表达,抑制Bax活化,抑制caspase-3和PARP活化。结论：1.Hcy通过上调DAPK的表达,进而影响Bcl-2/Bax的比率、活化caspase-3介导内皮细胞损伤。2.HSP27可能通过调节ROS水平和DAPK下游的线粒体凋亡途径来抑制Hcy诱导的内皮细胞凋亡,从而发挥保护内皮细胞的作用。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5

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