缺氧对大鼠心肌细胞损伤作用的机制研究

发布时间：2019-03-24 21:38

【摘要】：目的本研究主要探讨缺氧对大鼠心肌细胞造成的损伤及引起损伤的机制,为心力衰竭等疾病的临床治疗积累理论资料。方法(1)实验设计及分组:以大鼠心肌细胞株(H9C2)为材料,设计实验组与对照组,实验组条件为1%O2+5%CO2+94%N2、37℃条件下三气培养箱中缺氧培养;对照组条件为95%Air、5%CO2、37℃CO2培养箱正常培养。分别设3h、6h、12h、24h、48h时段取材,观察细胞的各项指标。(2)细胞的生长及活力的观察:分段取材使用台盼蓝对其染色,使用全自动细胞计数仪进行细胞计数并绘制细胞生长曲线;利用ELISA法和CCK-8试剂盒检测各时间点的OD值来判断细胞活力;使用细胞实时观测仪(Cellasic)在不同时间点内连续观测细胞生长变化情况以及缺氧对细胞造成的损伤状态。(3)线粒体功能检测:对培养24h时两组细胞取材并固定切片,利用透射电镜观察不同缺氧时间下改变;使用活性氧检测试剂盒通过流式细胞术检测各时间点下细胞内活性氧含量的变化;以线粒体呼吸链中核心蛋白线粒体色素C为靶蛋白,通过Western blot法检测各时间段的表达水平,以此判断对线粒体的损伤程度。(4)细胞凋亡的观察:利用ELISA法检测细胞各时期的吸光度来验证凋亡因子caspase 3的活性程度;使用荧光染料Hoest 33342对0h、24h、48h的两组细胞进行染色,借助荧光显微镜直观判断细胞的凋亡情况;使用7-AAD及Annexin V-APC对细胞进行标记再利用流式细胞术检测各时间段两组细胞的早期凋亡率。(5)细胞坏死的观察:使用ELISA法检测乳酸脱氢酶(LDH)在各时间段的表达程度,以此为指标判断细胞坏死程度。结果(1)细胞的生长及活力的观察:通过细胞计数仪观察随着缺氧时间的增加,心肌细胞生长速率不断减慢。与对照组相比,24h时两组细胞生长差异最大,缺氧24h组比对照组细胞生长率下降了1.53倍(P0.01)。使用CCK-8试剂盒检测出随着缺氧时间的增加,心肌细胞存活率均明显降低。6h时两组细胞生长差异最大,缺氧6h组比对照组细胞生长率下降了1.53倍(P0.01)。通过细胞生长的实时动态观测发现缺氧6小时后心肌细胞形态开始发生改变,缺氧12小时后心肌细胞的胞质出现空泡和细胞皱缩,缺氧48小时细胞基本全部死亡。(2)线粒体功能检测:透射电镜下缺氧24小时可见心肌细胞线粒体结构明显损伤。缺氧6小时开始,ROS释放水平开始升高,24h两组细胞内ROS水平差异最大,缺氧24h组细胞内ROS的表达水平升高了7.59倍(P0.01)。细胞内细胞色素C含量在缺氧3小时处开始出现差异,与正常组比较,缺氧3h组细胞色素C蛋白的表达水平升高了0.79倍(P0.01)。与缺氧12h组比较,缺氧24h组细胞色素C蛋白的表达水平升高了0.41倍(P0.01)。(3)细胞凋亡的观察:随着缺氧时间的增加,caspase-3活性水平也不断增加,缺氧3小时处开始出现差异,与正常组比较,缺氧3h组caspase-3活性水平升高了0.67倍(P0.01)。缺氧48小时活性最高,与缺氧24h组比较,缺氧48h组caspase-3活性水平升高了0.27倍(P0.01)。通过荧光显微镜观察到,缺氧培养的大鼠心肌细胞缺氧处理24h、48h后,细胞呈现典型的凋亡形态学变化。通过流式细胞术反映出随着缺氧时间的不断增加心肌细胞的早期凋亡率明显增加。缺氧24h细胞凋亡率最高,与正常组比较,缺氧24h组细胞凋亡水平升高了14.14倍(P0.01)。(4)细胞坏死的观察:利用ELISA法检测出随着缺氧时间的增加心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放率明显增高,缺氧48小时释放率最高,与正常组相比,缺氧组的乳酸脱氢酶LDH水平升高了3.1倍(P0.01)。结论缺氧能够造成大鼠心肌细胞株(H9C2)的细胞生长、存活率均明显降低、细胞形态明显改变以及线粒体损伤,线粒体损伤会导致细胞凋亡,缺氧时间的增加会造成细胞坏死。
[Abstract]:Objective To study the mechanism of hypoxia on the myocardial cells of rats and the mechanism of injury, and to accumulate the theoretical data for the clinical treatment of heart failure and other diseases. Method (1) Experimental design and grouping: The experimental group and the control group were designed with the rat myocardial cell line (H9C2) as the material. The condition of the experimental group was 1% O2 + 5% CO2 + 94% N2, and the condition of the control group was 95% Air,5% CO2, and the CO2 incubator at 37 鈩，

本文编号：2446705