枸橼酸预处理对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡和再灌注心律失常的影响及其分子机制研究

发布时间：2019-03-26 21:19

【摘要】：背景持续一定时间的缺血后,重新实现血流再灌注,不但没能减少缺血组织器官的损伤,反而导致更严重的损伤,被称为缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,I/RI)。伴随临床工作中实现血运重建的新措施和新技术的不断发展,缺血再灌注损伤也逐渐成为临床实践中受到广泛关注的重大课题,需要得到迫切、有效的解决。詹宁斯于1960年首次提及心肌缺血再灌注损伤的概念,揭示了即使实现血流再灌注,心肌超微结构发生坏死的病理过程仍将持续,甚至出现不可逆性的损伤,这一观点的发表逐步得到了医学界的关注和进一步证实。心肌缺血再灌注后,缺血心肌组织细胞的超微结构、代谢、功能及电生理的损害进一步加重,导致病情更加恶化,甚至不可逆,由此产生的病理生理过程,即为缺血再灌注损伤。闭塞的冠状动脉实现血运重建,梗死区心肌组织恢复血流灌注后的一段时间内,出现低血压、休克、泵功能衰竭、恶性心律失常甚至猝死等多种并发症,导致病情不断恶化。因此,缺血再灌注损伤的发生机制及相关的防治措施逐渐受到医学界的广泛重视,并致力于探索能有效防治I/RI发生和进展的措施和手段。直接经皮冠状动脉介入治疗(primary percutaneous coronary intervention,PPCI)是急性心肌梗死最有效的治疗手段。近几年来,PPCI治疗越来越多,随之心肌缺血再灌注损伤(I/RI)也逐渐成为血运重建术后血流动力学异常、泵功能衰竭、恶性心律失常甚至死亡的重要因素。据统计,有60%以上的急性心梗患者PCI术后出现围手术期的可逆性泵功能衰竭,因而,如何防治缺血心肌I/RI的研究,逐渐成为心血管专业不断探索的热点。心脏在缺血再灌注过程中会出现以下的病理生理改变：1.心肌顿抑(myocardial stunning)。心肌组织发生了一次或数次的短暂的缺血,并没有发生心肌的坏死,仅表现为心肌功能异常,在血流重新灌注后,心肌组织的血液灌注已恢复正常或接正常,但缺血导致的心肌功能异常的病理现象仍在一定时间内存在着。缺血的心肌组织接受再灌注后出现损伤改变,导致的心肌功能异常在持续一定时间(大约3-24h)后,逐渐恢复正常状态,这种病理改变是暂时的,可逆的。令人印象深刻的是,再灌注后心肌收缩功能异常持续的时间往往超过缺血的时间,例如狗的心脏缺血时间为15min,但再灌注后心肌泵功能的异常将维持1天以上。临床上,该病理改变于心绞痛反复发作、急性心肌梗死冠状动脉血运重建治疗后并不少见。研究发现心绞痛的患者即使通过药物干预后疼痛与不适感消失,但检测到他的心脏异常运动有可能会持续几天。又如发生急性心肌梗死的患者在进行溶栓治疗后,虽然堵塞的冠脉血管已经恢复血流,但患者心脏的收缩功能并没有马上恢复到原来的水平。因此,评价溶栓或心脏手术疗效应在再灌注后2周左右进行为宜。有研究此现象的发生机制的指出,可能是由于缺血后线粒体的功能发生了障碍,合成的ATP数量大幅减少,无氧酵解增加,氧自由基不断增多,激活、促进炎症反应如炎性细胞聚集以及钙超载等,导致了心肌顿抑这一现象的发生。2.心肌冬眠(myocardial hibernating)。心肌在各种原因下导致了缺血性损伤,随后的再灌注虽然没有导致心肌出现坏死,但心肌犹如冬眠一样,出现代谢降低,超微结构发生重构,ATP合成能力下降,氧合需求下降,心肌出现了功能与灌注的再分配现象,维持更为平衡的血流与功能,此时心肌氧耗减少,收缩力降低,通过这种自我保护性调节方式,避免进展至心肌坏死,保存尽可能多的存活心肌细胞,也是缺血心肌对再灌注损伤的一种适应性、自我调节的保护机制。因此,冬眠心肌的特征性表现为血液灌注低下的状态下,心肌能够重新调整能量合成与代谢的平衡状态,降低心肌的血流灌注量、减少心肌组织的氧耗量,通过类似于代偿的机制,让仍旧正常的心肌细胞代替所有的功能。其发生机制也与线粒体合成能力下降而出现的一系列改变有关,表现为脂肪酸合成减少,糖转化利用增加,能力储备下降。冬眠心肌也会出现细胞的退行性变性,心肌结构变化的适应性或心肌纤维化如果长时间维持下去,将失去恢复的能力,因此这种适应性的改变是有限度的、不完全的。CCB(钙通道拮抗剂)、β受体阻滞剂和ACEI(血管紧张素转换酶抑制剂)可促进冬眠心肌的代谢和功能的逐渐改善。3.无复流现象。结扎犬冠状动脉引起的供血区域心肌缺血,一段时间后重新开放结扎的动脉,血流再次灌注缺血区心肌,此时的缺血区心肌并不能得到有效的灌注,这种现象被称为无复流或无再灌注。作为一种独特的缺血再灌注损伤,它是缺血区组织器官血流低灌注的延续,缺血组织并没有得到有效的再灌注,缺血持续存在,严重妨碍了缺血组织心肌的功能恢复。无复流现象发生在心内膜下心肌和心内膜下心肌微血管,冠状动脉分支在终末分支的直径比较小,心内膜下心肌承受的张力高于其他部位,承担心肌收缩挤压和心室腔内高充盈压的双重作用,需氧量最大,对血流低灌注的耐受能力也最差。4.细胞凋亡。细胞凋亡是心肌IRI的病理特征性改变,形态特征上显示出发生减少的细胞体积、胞质浓缩,核固缩,细胞膜最终把细胞浆与已经出现断裂的染色质分割并且包围起来而形成的致密颗粒,成为凋亡小体(apoptotic body)。它的细胞膜仍完整,也保持着相对完整的细胞器结构,既没有发生炎性反应,也没有出现细胞内容物的外溢。细胞坏死是病理性攻击的结果,破坏了细胞膜和细胞结构,细胞崩解,细胞内容物的释放,出现进行性的损伤和炎症反应。在心肌如果出现6小时内的缺血,细胞死亡主要是以细胞凋亡的形式出现,但当缺血持续延长,会出现明显的心肌坏死并且在24小时内将达到峰值,心肌细胞虽然有一定的缺血耐受能力,但如果超出了其耐受的最大时间间隔,就会逐渐出现细胞凋亡。心肌细胞凋亡出现于心肌缺血的早期阶段,如果延续到心肌缺血的晚期阶段,心肌就会发生大量坏死。以什么方式死亡取决于细胞内ATP的的存储量,而当线粒体所合成的ATP耗尽,尤其在心肌细胞持续严重缺血时,细胞凋亡可转化为坏死。心肌缺血早期阶段的死亡形式表现为凋亡,而在缺血的晚期阶段坏死则成为主要的表现。心肌细胞凋亡是心肌缺血／再灌注损伤的重要病理改变。有效防治心肌细胞凋亡的发生、发展也成为防治心肌缺血/再灌注损伤的新方向和新手段。短时间的心肌缺血可以增加心肌组织对缺血的耐受性,从而减轻心肌缺血／再灌注损伤。因此,预处理是一种损伤性刺激,以提高心肌细胞抵抗力或适应能。连续3次长度为5分钟的短暂缺血及连续10次的持续2分钟缺血可诱导缺血预适应(ischemic precondition,IP)的发生,而仅仅1或2次、持续约5分钟的血流低灌注并不能促使缺血预适应的出现,在诱导成功与否方面血流低灌注的持续时间和发生频次可能起到决定作用。提示适当的刺激可产生缺血预适应,缺血时间过短,不易产生缺血预适应,缺血时间过久,心肌发生不可逆损伤。如低灌注时间超过30min,缺血预适应效应会发生减弱,如果超过90-120min的低灌注时间,几乎不会造成缺血预适应。枸橼酸一般作为血液抗凝剂。在凝血过程中钙离子可促进形成纤维蛋白、凝血酶、凝血因子Ⅲ,促进血小板活化等。枸橼酸可与游离的Ca2+结合形成可溶性的络合物——枸橼酸钙,降低血浆Ca2+浓度,从而发挥抑制凝血,阻止血液凝固的作用。目的：目前在心肌缺血再灌注过程中枸橼酸预处理的保护作用和相关机制研究鲜有报道。本实验应用结扎冠状动脉前降支法建立在体大鼠冠状动脉缺血再灌注模型,观察枸橼酸预处理对I/R大鼠再灌注心律失常和心功能的影响,及心肌组织凋亡相关蛋白表达水平的作用,并通过体外心肌细胞培养,研究枸橼酸预处理在缺血再灌注损伤中减少心肌凋亡的作用及调控的信号通道,为临床实践中减轻心肌缺血再灌注损伤进行有益探索。方法：1.大鼠心肌I/R梗死模型的建立及实验分组：建立大鼠心肌I/R梗死模型。健康的雄性SD大鼠被随机化分为3组,每组各15只。I/R组：缺血30min/再灌注120min,再灌注期间经股静脉输注生理盐水；I/R+citrate组：同样方法建立模型,在再灌注前经股静脉输注枸橼酸(citrate,0.05mol/L);Sham组：仅开放胸腔,不进行缺血再灌注。2.接Ⅱ导联心电连接线记录心电图,记录缺血30min、再灌注120min心律失常发生情况。3.心肌梗死面积和心功能的测量：TTC染色法测量MI方法。对各组射血分数(EF)、左室内压峰值(LVSP)、左室舒张末期压(LVEDP)、左室内压上升最大变化速率(+dp/dtmax)、左室内压下降最大变化速率(-dp/dtmax)进行检测。4.血清酶LDH与CK及抗氧自由基指标SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)与GSH-PX(谷胱甘肽过氧化物酶)的检测。5.心肌细胞凋亡和凋亡相关蛋白‘;aspase-9、caspase-7、caspase-3、Bcl-2与Bax表达水平的检测：荧光TUNEL联合免疫荧光检测心肌细胞凋亡；Western blot法检测凋亡相关蛋白caspase-9、caspase-7、caspase-3、Bcl-2与Bax表达水平。6.乳鼠心肌细胞培养和心肌细胞缺血再灌注模型建立及实验分组。7. PI3K/AKT通路及凋亡相关蛋白的检测与分析：通过心肌细胞缺血再灌注模型建立,应用Western blot测定p-PI3K、p-Akt的表达浓度,使用P13K特异性抑制剂LY294002(20μmol/L)对心肌细胞进行处理后,检测其凋亡相关蛋白caspase-9、caspase-7、caspase-3与Bax蛋白表达水平。结果：1.与Sham组比较,I/R组再灌注心律失常的发生明显增加,再灌注15min后即诱发出频发室性早搏、持续性室速、室颤等恶性心律失常。当采用枸橼酸0.05mol/L在再灌注前进行预处理后,各种室性心律失常发生次数明显下降(P0.01)。结果表明,枸橼酸预处理可减少心肌缺血再灌注时再灌注性心律失常的发生率。2.心功能的改变是本病重要表现之一。研究结果显示,与Sham组比较,I/R组EF、LVSP、LVEDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax指标均显著改变,差异有统计学意义(P0.01),心功能受损；当采用枸橼酸0.05mol/L在再灌注前进行预处理后,心功能有明显好转(P0.05)。与Sham组比较,I/R组中LDH与CK两个指标均显著升高,差异有统计学意义(P0.01),心肌受损；当采用枸橼酸进行预处理后,LDH与CK浓度均有明显的降低,心肌损伤明显好转(P0.05)。3.采用病理切片对结果进行验证,病理结果显示I/R组大鼠心脏出现明显梗死区,心肌梗死面积为(28.8±6.4)%。与I/R组比较,I/R Citrate组心肌梗死面积明显缩小,差异有统计学意义(P0.01)。与I/R Citrate组比较,I/R组死亡率显著升高(P0.01)。4.自由基清除障碍也是本病理过程的重要表现之一。与Sham组比较,I/R组SOD与GSH-PX水平降低,MDA水平升高(P0.01),提示在缺血再灌注损伤过程中心肌氧自由基清除能力降低；当采用枸橼酸进行预处理后,SOD与GSH-PX水平升高,MDA水平降低,心肌氧自由基清除能力有所恢复(P0.05)。5.统计结果显示,I/R组心肌组织中TUNEL染色阳性心肌细胞占(10.37±2.04)%。再灌注前经枸橼酸预处理后TUNEL染色阳性心肌细胞占(3.20±0.96)%,与I/R组比较,细胞凋亡明显减少(P0.01)。提示,枸橼酸预处理具有显著的减少心肌细胞凋亡的作用。6.对凋亡相关蛋白caspase-9、caspase-7、caspase-3、Bcl-2与Bax蛋白表达水平进行检测,发现I/R组心肌组织caspase-9、caspase-7、caspase-3与Bax蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P0.001)。与I/R组比较,再灌注前经枸橼酸预处理后,caspase-9、caspase-7、caspase-3及Bax蛋白表达水平明显减低(P0.001),Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P0.001)。这也显示了枸橼酸预处理具有明显减少心肌细胞凋亡的效应。7.枸橼酸预处理心肌细胞后,能够激活PI3K/Akt信号通路,与I/R组比较,I/R+citrate组(?)p-PI3K与p-Akt水平明显升高(P0.01)。为深入探讨枸橼酸预处理减少心肌细胞凋亡是否通过上调PI3K/Akt信号通路而实现,使用P13K特异性抑制剂LY294002(20μmol/L)对处理心肌细胞。结果发现,与(?)/R+Citrate组比较,I/R+Citrate+LY294002组各凋亡相关蛋白的表达水平均有显著改变(P0.01)。结论：1.枸橼酸预处理降低缺血再灌注大鼠心肌损伤,保护心功能,减少再灌注性心律失常的严重程度和发生率。2.I/R心肌细胞凋亡数量增加,心肌梗死面积扩大,枸橼酸预处理能够减少心肌细胞凋亡的发生,缩小心肌梗死面积,改善心脏舒缩功能。3.枸橼酸预处理显著提高心肌细胞的p-Akt水平,激活缺血再灌注心肌PI3K/Akt信号通路。使用PI3K特异性抑制剂LY294002,可以抑制p-Akt的升高,从而抑制枸橼酸预处理的对缺血再灌注心肌的保护作用。4.枸橼酸预处理激活缺血再灌注心肌PI3K/Akt信号通路,减少了细胞凋亡,缩小心肌梗死面积,保护心肌,降低再灌注心律失常的发生及严重程度。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

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