Notch信号系统在人骨髓间充质干细胞向内皮细胞诱导分化中的作用研究

发布时间：2019-05-29 05:39

【摘要】：背景:随着当今社会的发展,冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)相关的发生率和致死率较以往明显升高,其中以急性心肌梗死以及心功能不全为重要的死因。由于心肌细胞为不可再生细胞,心肌梗死后坏死细胞由纤维组织增生和瘢痕修复取代,梗死部位失去正常心肌收缩和传导能力,导致心脏肌细胞重构和心脏功能不全,邻近梗死区的心肌细胞由于缺血缺氧成为冬眠心肌。传统心肌梗死的治疗方案包括药物治疗、介入治疗和外科冠脉旁路移植手术,在一定程度上挽救了缺血心肌、改善心梗患者预后,但不能使已梗死心肌细胞重生。特别是部分弥漫性血管病变及微小血管病变患者,介入和外科治疗效果较差,支架植入后需长期口服抗血小板药物,外科搭桥后的桥血管也可能再次粥样硬化甚至闭塞。近年来组织工程和再生医学的进展为心肌梗死的治疗和康复提供了新的希望,通过细胞移植的方法促进血管新生、挽救缺血心肌、冬眠心肌成为缺血相关心脏疾病新的方向,这种新的治疗理念和思路也被称为“治疗性血管生成”。在有关细胞移植及再生治疗的临床和实验室研究中用到过许多种类细胞,其中包括脐静脉内皮细胞、内皮祖细胞、胚胎来源的干细胞、间充质多能干细胞等。其中骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells BMSCs)是一类来源骨髓的,不同于造血干细胞的成体干细胞,具有自我不断更新的能力和向多方向和谱系分化的潜能,在体外合适的条件诱导后,可向多种细胞类型发生分化。而且可以自体移植,易于将外源性的基因片段导入,因此成为热点的种子细胞候选对象。BMSCs在移植后发挥治疗性血管生成作用,主要归因于其向内皮细胞、心肌细胞分化、旁分泌作用促进血管新生,免疫调节作用控制梗死后炎症等。BMSCs向内皮样细胞发生分化的过程受多种因素调节,目前其具体机制仍有待深入探寻。Notch信号通道是一种在各物种、各细胞中广泛存在的高度保守信号途径,主要通过细胞相互直接接触的形式传导,在决定细胞分化方向及命运方面起重要的调控作用。在心血管系统的正常发育中Notch信号系统也起重要作用,它的异常激活或缺失都会导致心血管发育异常甚至是机体死亡。Notch信号通路在内皮血管细胞分化及动静脉选择、缺血诱导的新生血管形成中也扮演关键角色。本课题主要研究了人BMSCs在体外培养中向内皮样细胞诱导分化的可行性及Notch信号在BMSCs向内皮样细胞诱导分化过程中的作用和相关的机制,以便为更好地改进和发展BMSCs移植治疗缺血导致的心血管疾病提供实验和理论的依据。第一部分人BMSCs体外培养及诱导其向内皮细胞分化目的:体外培养人BMSCs,并用内皮细胞诱导剂诱导分化,观察其细胞形态、成血管能力、细胞表面标志物改变,明确BMSCs的内皮分化潜能。方法:(1)体外贴壁培养人BMSCs原代细胞,增殖传代至第三代(P3)作为研究对象,采用VEGFA165和b FGF联合诱导人BMSCs向内皮细胞分化,显微镜下观察诱导前和诱导后细胞间的形态改变。(2)通过免疫组织细胞化学法,检测诱导分化过程中各组细胞表面内皮细胞相关的标志物Flk-1、v WF的表达情况:实验中各分组为对照组和诱导组,诱导组经过内皮诱导液处理10天后取样做免疫组织化学检测,将诱导前后细胞接种在基底膜基质(matrigel)上观察其血管形成能力,ac-LDL吞噬实验观察细胞吞噬低密度脂蛋白能力。(3)采用蛋白免疫印迹法,观察诱导前后人BMSCs上Notch配体DLL4表达情况,明确DLL4参与BMSCs向内皮分化过程中。结果:(1)人类BMSCs诱导前显微镜下形态为:细长梭状、纺锤形,经VEGFA165和b FGF联合诱导后,部分细胞形态逐渐变为扁平、多角、短梭状。(2)人BMSCs在培养基中由VEGFA165和b FGF联合处理10d后,免疫组化鉴定表明细胞表达内皮细胞相关的标志物Flk-1和v WF。诱导后细胞接种到matrigel后,具备形成毛细血管网样结构能力,并具有吞噬Ac-LDL能力。(3)人BMSCs在内皮细胞诱导液中处理10d后,DLL4的蛋白表达较诱导前明显升高(P0.01)。结论:1、联合VEGF和b FGF诱导人BMSCs第三代细胞向内皮样细胞分化的方案是可行的,诱导的最佳浓度:50ng/ml VEGF+10ngb FGF。分化后细胞从形态和部分功能上与内皮细胞相似。2、诱导人BMSCs向内皮细胞分化的过程中,细胞表达的内皮相关细胞标志物随着诱导时间逐渐增加,具备了体外成血管能力和摄取ac-LDL的能力。3、诱导分化处理中,Notch信号的配体DLL4表达上调。第二部分:DLL4干扰质粒和过表达病毒构建及转染h BMSCs目的:采用基因载体技术,将合成的DLL4干扰序列和DLL4 homo序列分别用质粒和慢病毒载体携带,转染h BMSCs,构建DLL4表达干预模型,为后续研究Notch信号通路在MSCs内皮分化中的作用打下基础。方法:1通过聚合酶链反应(PCR)方法克隆得到目的基因片段,然后与骨架载体质粒分别双酶切,将酶切后的PCR产物与剪切后呈线性化的载体连接,进入感受态细胞中,经过筛选阳性菌落,抽取质粒,获得重组后携带目的基因的质粒载体。2采用混合寡核苷酸(oligomix)的方法,分别合成DLL4的两个片段,采用无缝克隆试剂盒连接,在载体LV5中完成重组,感受态细胞中筛选阳性菌落,抽取质粒酶切鉴定,然后进行慢病毒包装、纯化,最后感染h BMSCs。3用蛋白印迹实验验证DLL4干扰质粒和过表达慢病毒的效果。结果:DLL4干扰质粒和过表达慢病毒均可转入h BMSCs,且分别下调和增高DLL4的表达结论:DLL4干扰和过表达载体构建成功,转染h BMSCs并干预DLL4的表达,可用于后续实验。第三部分:Notch信号系统对人骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的影响目的:通过基因修饰技术,调高和降低DLL4在人BMSCs中的表达,检测转染干扰和过表达质粒后BMSCs向内皮细胞分化能力改变,明确Notch信号通道的相关下游因子在诱导过程中的改变,研究干预Notch信号的表达和激活对诱导之后细胞的内皮细胞特征的影响,以便提高诱导后内皮细胞增殖能力、迁移能力、促血管生成能力,更好促进BMSCs向内皮细胞诱导分化的临床应用。方法:1、VEGF联合b FGF诱导转染了DLL4干扰质粒和DLL4过表达慢病毒的人BMSCs向内皮细胞分化,免疫组织化学染色检测诱导细胞Flk-1和v WF表达。2、WB检测诱导分化过程中Notch信号通路下游分子Notch胞内片段(NICD)、Hes1、Hes5及内皮标志物Flk-1、v WF的表达,并用Notch1特异性阻断剂DAPT处理诱导中的人BMSCs,观察内皮细胞标志物转录产物水平及细胞成血管能力,吞噬Ac-LDL能力变化。结果:1转染干扰质粒的h BMSC免疫组化染色Flk-1和v WF染色强度为弱阳性,过表达慢病毒转染h BMSC免疫组化Flk-1和v WF中度阳性。2与普通诱导组相比,DLL4过表达h BMSC分化后表达NICD、Hes1、Hes5、Flk-1、v WF增加,DLL4干扰h BMSC分化后表达内皮标志物及下游基因表达下降,阻断Notch信号减少诱导处理后细胞表面内皮细胞标志物及Notch下游基因表达。3与普通诱导组相比,DLL4过表达h BMSC诱导分化后体外成血管能力增强,DLL4干扰h BMSC诱导后体外成血管能力和吞噬ac-LDL能力减弱,诱导晚期加入DAPT促进诱导细胞在胶体基质上形成血管网样结构的能力。结论:DLL4-Notch信号通路激活在VEGF+b FGF诱导h BMSC内皮方向分化过程中起促进作用,在诱导晚期阻断Notch受体后,分化后细胞在体外血管形成实验中生成更多血管网状结构。第四部分:卡诺醇对抗氧化应激促进大鼠骨髓多能成体祖细胞向内皮细胞转化目的:了解抗氧化剂卡诺醇保护间充质干细胞对抗氧化压力并促进内皮样分化的作用和机制,为抗氧化剂和Noch信号通路联合诱导间充质干细胞分化打下基础。方法:(1)大鼠MAPCs的培养及H_2O_2和卡诺醇对细胞增殖和活力的影响,MTT法检测细胞活性;(2)VEGF诱导大鼠MAPCs向内皮细胞分化,分别在卡诺醇预处理和未处理组里加入H_2O_2,检测活性氧簇水平ROS生成和细胞凋亡酶3活性;(3)蛋白印迹法检测诱导10d后的细胞内皮标志物及Nrf-2表达。结果:(1)H_2O_2对大鼠MAPCs的细胞增殖能力和活性产生抑制,MTT分析细胞呈浓度依赖性死亡,在27 um/L浓度达到50%死亡,卡诺醇预处理能呈剂量依赖提高细胞存活,浓度在0.2um/L时保护最强;(2)在MAPCs向内皮诱导分化过程中,H_2O_2明显增加了细胞的ROS水平、细胞凋亡酶3活性以及细胞凋亡率,而卡诺醇预处理可对抗这些作用;(3)检测诱导分化10天后的细胞内皮标志物发现H_2O_2处理组与对照组相比,OCT-4,Flk-1,CD 31表达明显下调。但是卡诺醇预处理后的H_2O_2处理组细胞内皮标志物上调,H_2O_2处理组与对照组相比Nrf-2表达减低,而卡诺醇预处理组与H_2O_2处理组相比明显增加了Nrf-2表达。结论:大鼠MAPCs向内皮分化过程中,H_2O_2增加细胞活性氧蔟水平和细胞凋亡,下调内皮细胞标志物表达,抗氧化剂卡诺醇预处理可促进内皮标志物表达和Nrf-2表达。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

【参考文献】