斑马鱼c-cbl基因Ring Finger结构域突变导致的骨髓增殖性疾病及功能研究

发布时间：2019-06-15 17:38

【摘要】：作为造血干细胞的关键能力,自我更新和分化受到细胞内转录因子和信号网络的共同严密调控。任何自我更新和分化的调控异常都可能导致血液疾病发生。通过反向遗传学的方法我们已经知道了一些基因如pten、bmi1、hoxb4、wnt等与造血干细胞的自我更新密切相关,但是已知的非常有限。因此我们在一个活体动物内进行全基因组饱和的、表型驱动的、无主观误差的正向遗传学筛选。基于斑马鱼造血系统遗传学调控网络与人类有高度的相似性,我们设计应用ENU化学诱变技术,获得了近1,000个斑马鱼F2代隐性遗传突变家系,采用全胚胎原位杂交技术在F3代中进行筛选,确定影响定向造血干细胞发育、迁移和自我更新的突变家系,随后定位克隆这些关键基因并评估它们在人类造血干细胞疾病和白血病肿瘤干细胞恶性转化中的地位和作用。目前已有的一些造血相关突变株,比如影响造血干细胞的早期发育的突变株spt(tbx16)、snh(bmp7)等,影响造血分化晚期各系的突变株如sau(als2)、ret(band3),但是直接影响造血干细胞的突变株很少,如bls等。我们的筛选使用的是定向造血干细胞的标记runx1、c-myb来做原位杂交,因此筛到的很多突变都与造血干细胞有着密切的关系,本论文应用c-myb作为造血干细胞的标记进行了大规模三代遗传学筛选,发现了一个在斑马鱼肾脏和尾部造血组织(cht)都有很明显且很特异表达升高的突变株ldd731。对这一突变株进行了造血表型的详细分析,得出以下几点结论:1)突变株ldd731定向造血干细胞有明显的增加,髓系、红系、单核巨噬系细胞也有明显的增加,而t淋巴细胞是正常的。定向造血干细胞的增加从3dpf(dayspost-fertilization)起已经可以通过原位杂交来区分,5dpf可以从光镜下区分,可看到尾部造血组织(cht)处有非常明显的细胞数目增加。2)突变株ldd731原始造血不受影响,血管形态正常,其他如神经干细胞和生殖干细胞染色也是正常的,因此可以确定这个突变株是非常特异地影响了斑马鱼的定向造血。3)突变株ldd731纯合致死,通常9-14dpf死亡。杂合子可存活,杂合子无定向造血干细胞明显增加的表型。4)磷酸化组蛋白3(ph3)增殖检测实验发现突变株ldd731细胞增殖明显增加。全胚胎介导的dutp缺口标记(tunel)实验表明细胞凋亡没有异常。对突变株进行5dpf外周血涂片瑞氏吉姆萨染色,与正常鱼外周血涂片染色相比,各阶段细胞均明显增加,包括个体较大、核质比很大的形态明显偏向于干、祖细胞的原始细胞。苏丹黑染色和o-dianisidine血红蛋白检测进一步证实粒细胞和红细胞成熟正常并有明显增殖的现象。以上这些都符合骨髓增殖性疾病(mpd),也称为骨髓增殖性恶性肿瘤(mpn)。随后我们对这一突变株进行了定位克隆,最终将突变基因定位在了斑马鱼15号染色体上的c-cbl基因,突变位点是第1144位碱基,从c突变为t,使第382位氨基酸从组氨酸突(h)变成了酪氨酸(y),突变位于这个基因非常保守的ring结构域。目前研究表明,c-cbl基因是一个负向调控自我更新和细胞周期的一个基因,是一个抑癌基因,并且它是一个e3泛素蛋白连接酶,ring结构域的主要功能是负向调控蛋白酪氨酸激酶受体。目前这一基因在人和鼠里的研究已很多,已有报道显示c-cbl基因突变后与骨髓增殖性疾病或者白血病密切相关。通过实验我们证实了ldd731的造血干细胞增殖表型的出现可能依赖flt3信号通路,这与小鼠的实验结果相一致,人类中也发现了与ldd731突变株位点一样的突变,相应的突变是398位氨基酸,也是从组氨酸突变为酪氨酸,科学家们对几百例骨髓增殖性恶性肿瘤(mpn)c-cbl基因测序中发现有该一突变的,当然还不能确定地说这一位点的突变导致了mpn,但是ldd731突变株给予了直接的证据。总体来说,我们的遗传学研究是很好的“基因组乒乓”的例子,将人和斑马鱼里的信息进行比较和对接,有助于我们更好地理解造血干细胞异常和白血病发生密切相关的基因及其机制。ldd731突变株是目前为止首个斑马鱼骨髓增殖性疾病的模型。参与骨髓增殖性疾病或白血病的信号通路很可能是非常复杂的,这突变株有助于我们理解信号通路的异常和致病机理的相关性,还可以用作药物筛选模型,为骨髓增殖性疾病和白血病提供靶向治疗研究的手段。
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【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R551.3

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