依达拉奉对1型糖尿病导致心肌损伤的保护作用的机制研究

发布时间：2019-07-22 14:24

【摘要】：糖尿病心肌损伤是一种具有明确糖尿病病史,继发于糖脂代谢紊乱,引起心脏结构和功能异常的病理状态,可进展为糖尿病心肌病,最终导致心力衰竭。它独立于冠状动脉粥样硬化性心血管疾病、高血压、结构性心脏病等。糖尿病心肌损伤继发心肌病是糖尿病患者主要的并发症之一。近年的流行病学资料显示,糖尿病的发病率正呈现逐年增加的趋势,由此糖尿病心肌病的发病率也迅速增加。糖尿病心肌损伤也是引起糖尿病患者心功能减退并不断恶化的主要原因之一。这不但严重影响了患者的生活质量和预后,也极大增加了社会财政负担。大量的研究表明,氧化应激和凋亡是引起糖尿病心肌损伤并最终发展为糖尿病心肌病的主要致病因素之一。抗氧化剂依达拉奉,最近已被公认为是一种潜在的心血管疾病保护剂。但是,依达拉奉对糖尿病相关的心脏并发症的保护作用鲜有报道。沉默信息调节因子2相关酶1(silent mating type information regulation 2 homolog1,SIRT-1)定位于几种抗氧化剂基因的调控区域,调控了多种抗氧化剂基因表达,并可上调过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator activated receptorγcoactivatorα,PGC-1α)表达,抑制活性氧(reaction oxygen species,ROS)导致的糖尿病心肌损伤。我们的前期研究表明,依达拉奉上调了心肌SIRT-1表达并抑制心肌细胞凋亡。由此我们推测依达拉奉对糖尿病心肌损伤的保护作用可能通过上调SIRT-1抑制氧化应激及凋亡来实现的。本研究在体内观察依达拉奉对1型糖尿病导致的心肌损伤大鼠心功能及心肌SIRT-1、PGC-1α、核因子网织红细胞2相关因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor 2,NRF-2)、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达的影响,探讨依达拉奉对1型糖尿病导致的心肌损伤的保护作用;在体外细胞实验上,观察依达拉奉对高糖诱导的H9c2心肌细胞的细胞活力、活性氧的影响,探讨依达拉奉是否改善心肌细胞氧化应激及凋亡;此外在细胞水平上,观察依达拉奉对高糖处理的H9c2心肌细胞内SIRT-1、PGC-1α、NRF-2、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达的影响,探讨依达拉奉对高糖处理的H9c2心肌细胞损伤的保护作用及其作用机制。实验方法和结果如下:1、依达拉奉对糖尿病心肌损伤的保护作用:采用6周龄的雄性Wistar大鼠,通过对大鼠一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg)制备1型糖尿病大鼠心肌损伤模型。成模后治疗组给予依达拉奉(6 mg/kg/day)腹腔注射治疗4周后,测量大鼠体重、血糖(BG)、大鼠血清胰岛素(INS)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD),超声心动图测量心功能,HE染色观察心肌形态学,TUNEL分析心肌细胞凋亡,检测氧化应激损伤及细胞凋亡关键蛋白SIRT-1、PGC-1α、NRF-2、Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达。体内实验的结果显示,依达拉奉(6 mg/kg/day)治疗4周后能够明显改善1型糖尿病大鼠的心功能,改善心肌组织病理形态,改善血清胰岛素的水平;TUNEL染色分析表明,与对照组相比,依达拉奉治疗后心肌细胞凋亡显著降低;对心肌组织的相关蛋白检测发现,与对照组相比,依达拉奉能增加心肌组织中SIRT-1、PGC-1α、NRF-2、Bcl-2表达,减少Bax、Caspase-3蛋白表达。体内实验结果说明,依达拉奉能明显改善1型糖尿病导致心肌损伤大鼠的心功能,减少心肌细胞凋亡,其保护作用可能与激活SIRT-1有关。2、依达拉奉保护高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的作用及其机制:H9c2细胞与各种浓度的EDA或高糖与EDA共孵育24小时,检测细胞毒性、ROS水平及SIRT-1、PGC-1α、NRF-2、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达,研究依达拉奉对高糖处理的H9c2心肌细胞的保护作用机制。结果表明,依达拉奉在高糖处理的H9c2心肌细胞中能减少心肌细胞毒性及ROS产生;与对照组相比,依达拉奉治疗增加高糖处理的H9c2心肌细胞中SIRT-1、PGC-1α、NRF-2、Bcl-2表达,减少Bax、Caspase-3蛋白表达。3、依达拉奉保护高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的分子机制:依达拉奉通过激活SIRT-1调控了氧化应激下细胞生长及存活,因此我们检测是否敲除SIRT-1会抑制依达拉奉的保护效应。结果表明,在高糖处理的H9c2细胞通过SIRT-1si RNA敲除可导致SIRT-1蛋白表达减少,伴随PGC-1α、NRF-2蛋白表达减少。此外,在高糖和依达拉奉共孵育敲除SIRT-1后,Bax和Caspase-3表达显著增加,Bcl-2表达显著减少。因此,该结果提示依达拉奉治疗主要是通过增加SIRT-1,进而增加PGC-1α和NRF-2表达,减轻高糖诱导的H9c2心肌细胞凋亡。本研究主要以SIRT-1为靶点,分别从体内(动物)水平和体外(细胞)水平两大方面研究了依达拉奉对1型糖尿病心肌损伤的保护作用以及作用机制。我们发现体内实验,依达拉奉明显改善大鼠心功能、氧化应激及凋亡,调控了抗氧化、凋亡相关蛋白的表达;在体外实验,依达拉奉治疗明显改善了高糖所致的H9c2心肌细胞的损伤及调控相关抗氧化蛋白及凋亡相关蛋白的表达,而这一作用主要与依达拉奉上调SIRT-1有关,该研究揭示了依达拉奉对糖尿病心肌损伤的保护作用,并进一步探讨依达拉奉对糖尿病心肌损伤的保护作用的分子机制,为依达拉奉作为治疗糖尿病心肌损伤药物的临床应用提供理论依据。
【图文】：

6 磷酸果糖转化为葡萄糖 6 磷酸。而在高糖血症，过量的葡萄糖导致的超氧阴离子激活氨基己糖通路，抑制蛋白激酶 Akt 诱导的 NOS 活化[92][ 93]，减少 NO 生成（4）激活多元醇通路，活化丙酮醛，促进 AGEs 及 RAGE 蓄积。多元醇通路利用一系列羰基化合物作为底物，并通过烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）将这些化合物还原成各自的糖醇。激活的醛糖还原酶将葡萄糖转化为山梨醇，山梨醇再通过山梨醇脱氢酶氧化为果糖，，引起细胞内山梨醇和果糖堆积，造成细胞内高渗，导致细胞损伤。NAD+是这个反应中的辅因子。高葡萄糖诱导的多元醇旁路引起细胞损伤的主要机制是在高血糖条件下，经山梨醇脱氢酶在醛糖还原酶（AR）途径使葡萄糖氧化增加[80]。增加的葡萄糖流通过电子传递链增加线粒体超氧阴离子的产生[94]。这改变了 NADPH/NADP+和 NADH /NAD+的比率，导致抗氧化酶辅因子还原型谷胱甘肽消耗，NADPH 是还原型谷胱甘肽再生所必需的辅因子，谷胱甘肽又是活性氧的重要清除剂，其减少会加重氧化应激，氧化应激又促进 AGE 前体和 PKC 激活剂甘油二酯的产生[82][95]。

图 1. 2 糖尿病心肌病发病机制示意图总之，氧化应激及凋亡在糖尿病所致的心肌损伤并最终发展为 DCM 的病理过程中扮演重要角色。寻找抗氧化应激、抗凋亡的分子靶点对糖尿病心肌病的精准治疗意义重大。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R542.2

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本文编号：2517674