参松养心对缺血心肌电重构、结构重构及微循环的效应与机制研究

发布时间：2019-08-13 18:04

【摘要】：心肌梗死(myocardial infarction, MI)是临床上常见的危重病症,我国流行病学资料显示,近年我国心肌梗死发病率和病死率急剧升高、且呈年轻化趋势¨。MI可致多种心律失常发生,梗死后恶性室性心律失常是MI最主要的死亡原因。国外流行病学调查显示,心脏性猝死75%为心梗后心律失常性猝死。因此正确评估和处理梗死后室性心律失常,对提高患者的生存率和生活质量有重要意义。MI后随着时间的延长,缺血心肌发生坏死、肥厚和纤维化改变,导致心室扩张、张力增加,室壁运动异常。研究显示,MI后的这种病理性重构在梗死后一年内持续存在并不断进展,使心脏收缩和舒张功能逐渐减弱、并可导致恶性心律失常的发生。因此在MI后早期有效的干预心室重构,减轻心肌纤维化,将有助于提高心脏功能和减少心律失常的发生。心脏微血管是心肌组织进行物质交换、能量代谢以及信息调控的主要场所,MI后微循环功能障碍在心脏重塑中占有重要作用。近年,越来越多的临床证据表明,在具有冠心病风险患者的早期阶段,心脏微循环可能已经发生变化,其病理改变可能是梗死患者中期并发症发病率和死亡率增加的原因。目前,随着经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)及冠脉搭桥手术(coronary artery bypass grafting, CABG)水平的提高,AMI患者大血管再通率和存活率有所提高,然而术后心肌无复流现象却时常发生,研究表明心脏微循环功能障碍是主要原因。因此,临床上也有研究把微循环功能作为预测心梗患者长期高质量存活的一个指标MI/缺血后若能有效改善微循环状态将有助于显著提高心脏功能并逆转或延缓心肌重构。目前药物治疗仍是防治MI后心律失常发生的主要手段,临床上常规的药物疗法主要包括钠通道阻滞剂、β受体阻滞剂、钾通道阻滞剂、钙通道阻滞剂和洋地黄类[13]。然而,这些药物中很多最初被认为很有前途的抗心律失常药物在应用中被发现是增加而不是减少MI患者的死亡率。循证学研究发现,在MI病人康复期,部分离子通道阻滞剂有致心律失常效应,甚至增加死亡率。仅β受体阻滞剂较为安全,但因其负性心率和负性肌力作用使其应用受限。可见目前单一“阻滞与对抗”模式的心律失常药物干预难以起到对心梗后心律失常的良好治疗作用[18]。我们也由此推测,一种理想的治疗心梗后心律失常药物应具备多层面抗心律失常有效性且长期应用安全性的效用。参松养心(Shensong Yangxin capsules, SSYX)是由丹参、黄连、桑寄生、甘松、龙骨、山茱萸、人参、五味子、赤芍、酸枣仁、麦冬、土鳖虫12种中药成分组成的复方中成药物[19]。该药物组方的配方原理是基于中医“承制调平”的脉络学说及通络理论,不同药物成分之间具有互补作用参松养心己获中国国家食品药品监督管理局(SFDA) (2003年,文件号Z20030058)批准,应用于临床治疗心律失常¨。动物实验发现,参松养心能明显抑制药物诱发的心律失常和缺血再灌注损伤诱发的心律失常。多中心临床研究表明,参松养心可有治疗器质性、非器质性室性早搏。临床随机对照研究显示,参松养心对室性早搏、阵发性房颤的治疗与西药疗效相当,且对相应的临床症状也有明显改善作用,改善症状优于西药组,且未呈现不良反应。单细胞膜片钳研究表明,参松养心对多种离子通道具有阻滞作用。最近有研究利用超高液相色谱-光谱法对口服参松养心原粉的大鼠的尿液进行检测,发现含有至少十种有效成分。由此我们推测,参松养心对梗死后心律失常的防治具有多重干预作用。然而,直到目前为止,有关参松养心对MI后心肌电生理的具体调节作用及机制研究甚少。基于此我们进行了本次的实验研究。本实验采用结扎家兔冠状动脉左回旋支制作心梗模型,应用在体电生理记录技术,微电极阵歹(Microelectrode array, MEA)技术等观察参松养心对梗死后兔缺血心肌在体电生理特性及电传导的影响,初步揭示其可能的作用机制。利用应用心肌声学微泡造影技术、透射电镜技术、CD34免疫荧光双标测技术、酶联免疫吸附技术观察参松养心对梗死2周家兔梗死周边区心肌组织重构及微循环灌注功能的影响,并运用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)技术和蛋白质印迹法(Western Blot)检测有关蛋白的表达水平,探讨其可能的作用机制。方法本研究分为以下三部分内容：一、心肌梗死兔心肌电生理改变及参松养心的干预作用研究以日本大耳兔为研究对象,采用结扎家兔冠状动脉左回旋支制作心梗模型,分以下4组：假手术组(sham operation, SO; n=8)、心梗对照组(myocardial infarction, MI; n=8)、心梗胺碘酮组(myocardial infarction with amiodarone, AD;n=8)、心梗参松养心组(myocardial infarction with Shensong Yangxin, SSYX; n=8)。术后第2天,心梗胺碘酮组以胺碘酮0.05g/kg/d灌胃给药,心梗参松养心组以参松养心原粉0.4g/(kg.d)灌胃给药,假手术组和心梗对照组以等体积生理盐水灌胃给药,各组连续灌胃2周。于末次给药后禁食12小时,各组家兔行在体MEA检测,记录周边区心肌组织场电位(FP)指标,包括场电位最大负值(FPmin)、场电位持续时间(Fpdur)、总的激动时间(TAT)、TAT离散度和电兴奋传导速度(CV),并观察电激动传导方向变化情况。利用LEAD2000在体电生理记录仪检测周边区心肌单相动作电位时程(MAPD)、有效不应期(ERP)、跨壁复极离散度(TDR)和室颤阈值(VFT)变化。运用Real-time PCR和Western blot技术检测各组模型周边区心肌组织中缝隙连接蛋白43(CX43)和KV6.2 mRNA及蛋白的表达水平。二、心肌梗死兔心室重构及参松养心的干预作用研究实验动物、分组及造模方法同第一部分。运用心脏二维超声动检测各组家兔心功能变化,检测指标包括左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内经(LVESD)、左心室舒张末期容积(LVEDV)、左心室收缩末期容积(LVESV)左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室射血分数(LVEF)和E/A值。HE染色观察梗死周边区心肌组织的形态学改变。透射电镜观察周边区心肌细胞的超微结构变化。采用Masson三色染色观察周边区心肌组织胶原纤维的增生情况。运用Real-time PCR技术检测周边区心肌肌浆网Ca^2+-ATP酶-2a(SERCA2a)、钙离子释放通道蛋白-2(RYR2)、受磷蛋白(PLB)、钠钙交换体-1(NCX1)、转化生长因子-β1 (TGF-β1)、基质金属蛋白酶-2(MMP2)和金属基质蛋白酶-9(MMP9) mRNA的表达水平。Western blot检测周边区心肌中SERCA2a、RYR2、PLB、NCX1、I型胶原蛋白(COL Ⅰ)和Ⅲ型胶原蛋白(COL Ⅲ)蛋白表达量。三、心肌梗死兔缺血心肌微循环损伤及参松养心的干预作用研究实验动物、分组及造模方法同第一部分。运用心脏超声微泡造影技术分别于手术前、术后1天及术后2周对各组模型行心肌超声造影检测,记录指标包括给予Flash后再充盈稳定时的平台期峰值强度A、曲线斜率β以及A×β值；ELISA法检测各组血浆一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)、血栓素2(TXA2)和血管性血友病因子(vWF)水平；利用透射电镜观察各组家兔周边区心肌组织微血管内皮细胞的超微结构变化；采用CD34免疫荧光双染色法观察参松养心对梗死家兔周边区心肌微血管密度的干预情况；运用Real-time PCR技术检测周边区心肌血管内皮生长因子(VEGF、ET-1、前列腺素I 2(PGI2)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS) mRNA的表达水平；Western blot检测周边区心肌中血栓调节蛋白(TM)蛋白表达量。结果一、心肌梗死兔心肌电生理改变及参松养心的干预作用研究各组家兔MEA记录结果：与假手术组相比,心梗对照组周边区心肌组织FPmin、FPdur和CV明显减小,TAT和TAT离散度显著增大(P0.05)；心肌电兴奋传播方向紊乱,等电位线杂乱排列密集,可见异位兴奋灶。与心梗对照组比较,心梗胺碘酮组周边区心肌组织FPmin和CV明显减小,FPdur明显增大(P0.05),两组之间TAT和TAT离散度未见统计学差异；电兴奋传播方向紊乱改变不明显。与心梗胺碘酮组相比,心梗参松组周边区心肌组织FPdu、TAT和TAT离散度明显减小,FPmin和CV明显增大；电传导方向规整,且等电位线排列明显变疏。各组家兔心肌在体电生理检测结果：与假手术对照组比较,心梗对照组梗死周边区三层心肌MAPD90 (MAPD90.Ep、MAPD90.Mid、MAPD90.Endo)明显缩短,ERP、TDR显著增大,VFT明显降低(P0.05)。与心梗对照组比较,心梗胺碘酮组和心梗参松组三层心肌MAPD90(MAPD90.Epi、MAPD90.Mid、MAPD90.Endo)和ERP均明显延长(P0.05)。与心梗胺碘酮组相比,心梗参松组三层心肌MAPD90(MAPD90.Epi、MAPD90.Mid、MAPD90.Endo)明显小于心梗胺碘酮组(P0.05),两组间ERP、TDR和VFT无明显统计学差异。各组家兔周边区心肌CX43和KV6.1mRNA及蛋白的表达：与假手术组相比,心梗对照组和心梗胺碘酮组CX43 mRNA和蛋白表达量明显减少,KV6.2mRNA和蛋白表达量显著升高(P0.05)。与心梗对照组和心梗胺碘酮组相比,参松养心显著增加梗死周边区心肌组织CX43 mRNA和蛋白表达量,KV6.2mRNA和蛋白表达量明显降低(P0.05)。二、心肌梗死兔心室重构及参松养心的干预作用研究各组家兔心脏功能检测结果：与假手术对照组相比,心梗对照组家兔心功能明显降低(P0.05)。与心梗对照组比较,心梗胺碘酮组LVESD、LVESV减小(P0.05)；心梗参松组LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV减小(P0.05),LVFS、LVEF、E/A值增大(P0.05)。与心梗胺碘酮组比较,心梗参松组LVESD、 LVEDV、LVESV减小(P0.05), LVEF、E/A值增大(P0.05)。各组家兔周边区心肌HE染色及透射电镜超微结构观察结果：心梗对照组家兔周边区心肌组织形态学改变显著,表现为细胞排列紊乱,可见萎缩、断裂的肌纤维,局部出现明显灶性坏死。透射电镜观察心肌超微结构表现为,心梗对照组心肌纤维排列紊乱,Z线粗细不等,甚至断裂或消失；心肌间质及核周有明显水肿；线粒体形态各异,膜结构不清晰,部分膜融合不清晰,线粒体嵴紊乱或消失,部分线粒体出现空化现象。心梗胺碘酮组较心梗对照组坏死有一定程度减轻,但细胞仍明显肿大；电镜下可见心肌间质及核周围有明显水肿,Z线排列虽较为整齐,但粗细不均、比较模糊,线粒体局部可见空泡、线粒体嵴紊乱。相对于前两组,心梗参松组心肌细胞坏死程度明显降低。电镜下心肌纤维排列有序,间质基本无水肿,大部分线粒体形态正常。各组家兔周边区心肌胶原纤维的变化：Masson染色结果显示,假手术组心肌纤维束排列紧密,心肌纤维间未见有明显胶原纤维增生。心梗对照组可见大面积胶原纤维增生,并呈网状分布于心肌纤维束之间。心梗胺碘酮组和心梗参松组周边区心肌组织胶原纤维增生有不同程度减轻,其中心梗参松组较心梗胺碘酮组胶原纤维增生减轻更为明显。各组家兔周边区心肌SERCA2a、RYR2、PLB、NCX1、TGF-β1和MMP-2mRNA表达：与对照组相比,心梗对照组周边区心肌SERCA2a、RyR2、PLB、 NCX1 mRNA水平显著下降,TGF-β1和MMP-2 mRNA水平显著升高(p0.05)。与心梗对照组相比,心梗胺碘酮组周边区心肌SERCA2a、PLB、TGF-β1及MMP-2mRNA表达水平未见明显改变,而RyR2、NCX1 mRNA表达增高(p0.05)；心梗参松组周边区心肌SERCA2a、RyR2、PLB、NCX1 mRNA表达均明显升高,TGF-β1、MMP-2 mRNA表达均明显下降(p0.05)。各组家兔周边区心肌SERCA2a、RYR2、PLB、NCX1、COL Ⅰ和COLⅢ蛋白表达：与假手术组相比,心梗对照组SERCA2a、RYR2、PLB和NCXl蛋白表达量明显减少,COL Ⅰ和COLⅢ蛋白含量明显升高(P0.05)。与心梗对照组相比,心梗胺碘酮组和心梗参松组SERCA2a、RYR2、PLB和NCX1蛋白表达明显增多,心梗参松组COL Ⅰ和COLⅢ蛋白表达量均明显降低(P0.05),相对于心梗胺碘酮组,心梗参松组各个指标改善更为显著(P0.05)。三、心肌梗死兔缺血心肌微循环损伤及参松养心的干预作用研究各组家兔周边区心肌组织微循环灌注量的变化：与假手术组比较,心梗对照组和心梗胺碘酮组术后2周A值、p值、A*p值均明显减小(P0.05)。与心梗对照组和心梗胺碘酮组比较,心梗参松组A值、p值、A*p值均明显升高(P0.05)。各组家兔周边区心肌组织微血管内皮超微结构的变化：假手术组微血管超微结构清晰,管腔光滑,基膜连续而完整,内皮细胞间紧密连接正常。心梗对照组微血管基膜不完整、紧密连接模糊,管腔不规则,细胞内未见明显线粒体结构。心梗参松组毛细血管内皮结构明显改善,可见紧密连接较明显,官腔较为光滑,线粒体融合、空泡化明显减轻。各组家兔周边区心肌组织微血管密度的变化：与假手术组相比,心梗对照组和心梗胺碘酮组CD34阳性计数和微血管相对密度均明显降低(P0.05)。与心梗对照组相比,心梗参松组周边区心肌组织CD34阳性计数和微血管相对密度显著增加(P0.05)。各组家兔血清TXA2、ET-1、vWF及NO水平：与假手术组相比,心梗对照组和心梗胺碘酮组TXA2、ET-1、vWF及NO明显升高(P0.05)。与心梗对照组和心梗胺碘酮组相比,心梗参松组血清TXA2、ET-1、vWF水平均明显降低(P0.05)。各组家兔周边区心肌VEGF、ET-1、PGI2和eNOS mRNA表达：与假手术组相比,心梗对照组和心梗胺碘酮组VEGF和ET-1 mRNA表达量明显升高,PGI2、eNOS mRNA表达量明显降低(P0.05)。与心梗对照组和心梗胺碘酮组比较,心梗参松组ET-1 mRNA表达量明显降低,VEGF、PGI2、eNOS mRNA表达量明显升高(P0.05)(P0.05)。各组家兔周边区心肌TM蛋白表达：与假手术组相比,心梗对照组和心梗胺碘酮组TM蛋白表达量明显减少(P0.05)。与心梗对照组相比,心梗参松组TM蛋白表达明显增多(P0.05)。结论1.参松养心对心肌梗死家兔周边区心肌在体电生理效应与胺碘酮相似,但不如胺碘酮显著；然其对电兴奋的传播具有明显优化效应。参松养心延长周边区心肌APD可能与下调Kv6.2的表达相关,提高电传导速度可能与上调CX43的表达相关。2.参松养心对心肌梗死家兔心功能有明显改善作用,揭示了参松养心通过上调梗死周边区心肌钙离子调控相关基因SERCA2ATPase、RYR2、PLB、NCX1表达改善心脏收缩功能,通过下调TGF-β和MMP-2表达抑制心肌胶原纤维病理性增生。3.参松养心对心肌梗死家兔周边区心肌组织微循环具有明显改善作用,证实参松养心通过调节内源性舒张和收缩活性物质之间的平衡,改善微循环,提高心肌组织的血氧供应；通过上调VEGF的表达促进周边区心肌微血管的新生。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.22
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本文编号：2526270