雄激素调控小鼠内皮祖细胞促血管形成作用机制的研究
发布时间：2019-09-03 17:57
【摘要】：目的：研究小鼠内皮祖细胞在雄激素的干预下向新生毛细血管发生的作用机制,明确雄激素调控内皮祖细胞的作用靶点,为基于内皮祖细胞修复心脏缺血性疾病的治疗思路提供理论依据。方法：首先分离、培养骨髓源性单个核细胞,基于内皮祖细胞培养体系EBM-2培养后获取EPCs,采用Dil-ac-LDL吞噬实验、以及流式细胞术检测细胞表面抗原CD31、CD34、CD11b、CD133、CD105、CD45,完成EPCs细胞鉴定。通过将EPCs与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养完成体夕matrigel管样结构结合实验,分别采用不同浓度梯度(Onmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L)的人工合成雄激素双氢睾酮(DHT)预处理EPCs,进而根据管样结构结合实验的结果获取DHT的最适宜干预浓度为10 nmol/L。结合基因芯片技术、信号通路分析软件筛选DHT干预下的EPCs各基因的表达差异。采用realtime PCR验证部分筛选出的异常表达基因,选定Efnb2为目的基因。构建shRNA-Enfb2逆转录病毒载体体外转染内皮祖细胞,realtime PCR检测转染后EPCs中Efnb2基因的表达水平。再次行matrigel管样结构结合实验,实验分为四组：①单纯EPCs对照组、②lOnmol/L DHT处理的EPCs组、③10nmol/L DHT+NC-shRNA处理EPCs组、④10nmol/L DHT+Efnb2-shRNA处理EPCs组。通过评估管样结构中荧光标记的EPCs数量评价各组EPCs向血管新生的生物学效应及其机制。最后基于小鼠下肢缺血模型的建立进行体内实验验证,体内研究分为五组：①空白对照组、②单纯EPCs移植组、③lOnmol/L DHT处理的EPCs移植组、④10nmol/L DHT+NC-shRNA处理EPCs移植组、⑤10nmol/L DHT+Efnb2-shRNA处理EPCs移植组。各组动物分别于术后第二天,在股总动脉结扎处两侧、股深动脉结扎处两侧及小腿腓肠肌处分别以微量注射针注射25μ1各组EPCs田胞液行干预治疗。下肢缺血手术后第7天、第14天(即EPCs注射后第5天、第12天)行下肢血流激光多普勒扫描评估下肢血流灌注水平。术后第14天处死小鼠,并获取下肢肌肉组织标本,通过免疫荧光判定EPCs存活量及新生毛细血管密度。所有实验重复3次,数据统计均采用Prism 6.0软件进行统计分析。数据以x±s表示,多组数据间比较采用单因素方差分析,两两组间比较采用t检验方法,以P0.05视为有显著统计学差异。结果：成功从小鼠长骨骨髓中分离获取骨髓单个核细胞,通过EBM-2培养基成功培养EPCs,流式细胞表面抗原检测及Dil-ac-LDL吞噬实验均提示符合EPCs鉴定标准。不同DHT浓度梯度干预EPCs后natrigel管样结构结合实验结果提示最适宜DHT浓度为10 nmol/L。采用基因芯片检测DHT干预后EPCs基因表达差异,再结合realtimePCR验证后初步筛选出11个异常表达基因：Egr1、Vcan、Fgf3、Cxcl 10、Cxcl 2、 Hdac4、Bmp7、Stfa211、Cldn1、Cdk2ap1、Efnb2。选取Efnb2为目的基因构建Efhb2-shRNA逆转录病毒载体,通过转导EPCs后观察荧光信号以及ealtime PCR验证基因抑制水平,提示成功获取稳转的Efnb2-shRNA-EPCs,可用于进一步研究。体外研究中经DHT预处理各组EPCs进行matrigel管样结构结合实验,结果提示相较单纯DHT处理组,同时经Efnb2-shRNA干预可显著削弱EPCs血管样分化的能力,提示Efnb2极有可能是DHT调控EPCs生物学行为的重要靶基因位点之一。体内研究成功构建小鼠下肢缺血模型,在进行各组细胞干预之后,激光多普勒结果提示10nmol/LDHT处理的EPCs移植组和10nmol/L DHT+NC-shRNA处理EPCs移植组均可获得显著的下肢血运重建效果,而携带Efnb2-shRNA的EPCs未能表现出理想的血管再生功能。此外lectin荧光染色(提示血管生成)和GFP+(EPCs示踪)也表现出相同的趋势,再次验证了体外研究部分的实验结果。结论：DHT能够显著提高内皮祖细胞向血管样结构的形成能力,其适宜的干预浓度为10nmol/L,而DHT正性调控内皮祖细胞的生物学行为可能是通过靶基因Efnb2的下游信号通路。维持适宜的DHT浓度以及上调Efnb2基因表达水平可显著提高内皮祖细胞在缺血性疾病中改善血流灌注的疗效。本研究为基于内皮祖细胞修复缺血性心脏病的治疗思路提供了实验基础。
【图文】：
夷光显微镜下因ＥＰＣｓ吞隧Ｄｉｌ－ａｃ－ＬＤＬ，贴壁细胞的细胞质内含红色巧光，而逡逑细胞核染色表现为蓝色焚光，阳性染色率近１００％，提示该贴壁细胞可较好的吞睡逡逑ＤＵ－ａｃ－ＬＤＬ邋（图２）。逡逑ＢＢｇｇｉｔｊｉｉｏｒＴａＰｉｔｇｉ逡逑媝画嫇逡逑图２．邸Ｃｓ吞随Ｄｉｌ－ａｃ－ＬＤＬ染色结果逡逑３．３流式细胞仪鉴定ＢＭ－ＭＮＣｓ逡逑将获取的ＢＭ－ＭＮＣｓ通过流式细胞仪分析，细胞表面抗原表达为ＣＤ１３３邋（９３．３逡逑±邋１．４％）、ＣＤ１０５邋（９１．１邋±邋１．３0／0）、ＣＤ４５邋（％．１邋±邋０．２0／0）、ＣＤ１邋化（６２．１邋±逡逑６．５％）、ＣＤ３１邋（１４．５邋±邋１．４0／0）、ＣＤ３４邋（５．６邋±邋１．２％）。提示经培养诱导分化获取的逡逑细胞群符合普遍认为的ＥＰＣｓ特征，可应用于后续实验（图３）。逡逑１６逡逑
图１．倒置显微镜观察ＥＰＣｓ形态逡逑３．２邋Ｄｉｌ－ａｃ－ＬＤＬ吞y笛殄义弦墓庀晕⒕迪乱颍牛校茫笸趟恚模椋欤幔悖蹋模蹋谙赴南赴誓诤焐晒猓义
本文编号：2531500
【图文】：
夷光显微镜下因ＥＰＣｓ吞隧Ｄｉｌ－ａｃ－ＬＤＬ，贴壁细胞的细胞质内含红色巧光，而逡逑细胞核染色表现为蓝色焚光，阳性染色率近１００％，提示该贴壁细胞可较好的吞睡逡逑ＤＵ－ａｃ－ＬＤＬ邋（图２）。逡逑ＢＢｇｇｉｔｊｉｉｏｒＴａＰｉｔｇｉ逡逑媝画嫇逡逑图２．邸Ｃｓ吞随Ｄｉｌ－ａｃ－ＬＤＬ染色结果逡逑３．３流式细胞仪鉴定ＢＭ－ＭＮＣｓ逡逑将获取的ＢＭ－ＭＮＣｓ通过流式细胞仪分析，细胞表面抗原表达为ＣＤ１３３邋（９３．３逡逑±邋１．４％）、ＣＤ１０５邋（９１．１邋±邋１．３0／0）、ＣＤ４５邋（％．１邋±邋０．２0／0）、ＣＤ１邋化（６２．１邋±逡逑６．５％）、ＣＤ３１邋（１４．５邋±邋１．４0／0）、ＣＤ３４邋（５．６邋±邋１．２％）。提示经培养诱导分化获取的逡逑细胞群符合普遍认为的ＥＰＣｓ特征，可应用于后续实验（图３）。逡逑１６逡逑
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