Klotho蛋白改善人EPCs功能、修复血管损伤的研究

发布时间：2017-03-18 06:02

  本文关键词：Klotho蛋白改善人EPCs功能、修复血管损伤的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景和目的血管损伤性疾病如动脉粥样硬化等易导致心力衰竭、肢体坏死、瘫痪等后果,是严重威胁人类健康的常见病、多发病。因此,积极探讨损伤血管修复的研究具有重大科学意义和社会经济效益。血管壁主要由覆盖血管内膜的内皮细胞和中膜的平滑肌细胞构成,是生理条件下保持血管结构功能正常的基本成分。内皮细胞损伤后可导致粥样斑块形成、平滑肌细胞增殖,是血管损伤性疾病发生、发展的重要病理生理基础。成熟内皮是终末分化细胞,再生能力有限,针对原位内皮的防治策略不能有效修复损伤性血管。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一类可以分化成成熟内皮细胞的前体细胞,当机体血管发生损伤时,EPCs能够通过迁移、黏附到损伤部位,增殖、分化成内皮细胞,修复损伤血管,是目前再生医学研究的热点与前沿。研究发现EPCs会随着年龄的增长而衰老,具体表现在EPCs结构退行性变、功能减退,数量减少,血管内皮损伤后修复能力下降。Klotho蛋白(KL)蛋白是一种内源性抗衰老物质,主要在肾小管上皮表达,有膜结合型和分泌型两种异构体。Klotho蛋白基因敲除的小鼠骨髓和外周血中EPCs数量显著降低,提示Klotho蛋白作为重要抗衰老因素之一可能参与EPCs的功能调控和血管损伤修复。本研究拟探讨Klotho蛋白对EPCs分化、增殖、迁移、黏附和旁分泌等细胞功能的影响;并构建C57BL/6小鼠颈动脉损伤模型以揭示其能否通过EPCs动员、归巢促进血管损伤修复。方法从健康人外周血中分离并诱导培养EPCs,观察细胞形态并利用其摄取DIL-ac-LDL和特异性结合UEA-1进行鉴定。分别给予0.1、1、10nmol/L Klotho蛋白刺激,同时设置PBS空白对照组、VEGF组(10nmol/L)和Akt信号通路抑制组(同时加入10nmol/L Klotho蛋白和1:1000的Akt抑制剂)。利用流式细胞术检测不同浓度Klotho蛋白诱导培养时各组细胞中CD34+/CD133+和CD31+/v WF+阳性率;Transwell方法检测各组EPCs的迁移能力;细胞黏附实验检测各组细胞的黏附能力;ELISA方法检测各组EPCs旁分泌SDF-1、b FGF、EGF等细胞因子变化;Western-blot方法检测各组EPCs中VEGF和VEGFR-2表达变化。构建C57BL/6小鼠颈动脉损伤模型,分别静脉注射生理盐水、Klotho蛋白、VEGF、Klotho蛋白+VEGF进行干预。利用流式细胞术检测3d时Klotho蛋白对颈动脉损伤小鼠外周血中EPCs动员的影响;同时ELISA方法检测Klotho蛋白对颈动脉损伤小鼠外周血中VEGF、SDF-1、EGF、b FGF表达的影响;测定Klotho蛋白处理颈动脉损伤小鼠不同时期外周血中ET-1和NO含量的变化;利用活细胞荧光染料CM-DiI和Dio-perchlorate标记经Klotho蛋白诱导处理的EPCs并通过尾静脉注射到颈动脉损伤小鼠体内,3d后取损伤段颈动脉,暴露内膜面激光共聚焦显微镜下观察检测各组EPCs的归巢情况;14d时利用cy5-CD31标记归巢EPCs分化的内皮细胞,检测各组颈动脉损伤小鼠归巢EPCs的再内皮化情况;HE染色检测各组颈动脉损伤血管内膜增生的变化。结果我们发现从健康人外周血单核细胞层中可分离诱导培养得到DIL-ac-LDL摄取和UEA-1结合双阳性的EPCs。流式细胞检测发现0.1、1、10nmol/L Klotho蛋白均能够显著增加CD34+/CD133+EPCs和CD31+/v WF+内皮细胞的阳性率(vs.对照组,P?0.05);Transwell、细胞粘附和ELISA实验发现不同浓度Klotho蛋白能够显著促进人EPCs迁移、黏附和细胞因子SDF-1、EGF、b FGF的旁分泌能力(vs.对照组,P?0.05);同时Western-blot检测发现0.1、1、10nmol/L Klotho蛋白作用能够促进EPCs中VEGF和VEGFR-2的表达(vs.对照组,P?0.05);而10nmol/L Klotho蛋白和Akt信号通路抑制剂Akt inhibitor(1:1000)同时作用于人EPCs时,CD34+/CD133+EPCs和CD31+/v WF+内皮细胞的阳性率显著降低,同时EPCs迁移、黏附和细胞因子SDF-1、EGF、b FGF的旁分泌能力也随之显著降低(vs.10nmol/L Klotho蛋白,P?0.05)。利用导丝损伤建立了C57BL/6颈动脉损伤模型后,流式细胞检测发现Klotho蛋白和VEGF均能显著增加颈动脉损伤小鼠外周血EPCs数量(vs.对照组,P?0.05);同时刺激SDF-1、bFGF、EGF、VEGF等因子的分泌(vs.对照组,P?0.05);增加外周血中NO分泌而降低ET-1的表达(vs.对照组,P?0.05);并能够显著增加损伤区域归巢EPCs数量并降低损伤血管内膜增生(vs.对照组,P?0.05)。结论本课题首次直接揭示Klotho蛋白可促进人EPCs体外分化、迁移、黏附及旁分泌能力,其机制可能与促进VEGF/VEGFR-2表达及Akt信号通路有关。在体研究发现Klotho蛋白能够促进颈动脉损伤小鼠体内EPCs从骨髓动员到外周血,增加VEGF、SDF-1、bFGF、EGF等促血管修复因子的分泌,显著提高EPCs归巢至靶区域,促进损伤血管再内皮化,抑制新生内膜增生,从而修复损伤血管。
【关键词】：Klotho蛋白 内皮祖细胞 迁移 黏附 血管损伤 动员 归巢 再内皮化
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543
【目录】：

• 英文缩写索引4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-12
• 第二章 Klotho蛋白对人EPCs分化、迁移、黏附、旁分泌的影响12-29
• 2.1 材料和方法12-17
• 2.2 结果17-26
• 2.3 讨论26-28
• 2.4 小结28-29
• 第三章 Klotho蛋白对颈动脉血管损伤修复的影响29-43
• 3.1 材料和方法30-33
• 3.2 结果33-40
• 3.3 讨论40-42
• 3.4 小结42-43
• 全文结论43-44
• 参考文献44-50
• 文献综述 Klotho蛋白与相关疾病的研究进展50-57
• 参考文献54-57
• 研究生期间发表论文57-58
• 致谢58

【参考文献】

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1 余金生,梁扩寰,田德安,王天才,唐望先,张文英,刘梅;一氧化氮和内皮素对肝硬化大鼠离体内脏血管条舒缩的影响[J];中国病理生理杂志;2001年09期

2 袁丹;陈海平;;抗衰老Klotho基因的功能及与人类疾病的关系[J];中国老年学杂志;2010年14期

  本文关键词：Klotho蛋白改善人EPCs功能、修复血管损伤的研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：254005