AF9在高效蛋白质转导技术重编程BM-MSCs为心脏祖细胞中的作用

发布时间：2019-09-23 15:25

【摘要】：目的:心血管系统疾病(cardiaovascular disease,CVD)是威胁我国公众健康的头号杀手,遗憾的是,目前的治疗策略只能延缓疾病进展,不能让失去的心肌细胞再生。近年来,多项临床前和临床试验证明心脏祖/干细胞(cardiac progenitor/stem cells,CPCs/CSCs)治疗应用于心脏再生修复是可行的、安全的。使用内源性CPCs需要进行心脏活检,这对于危重患者具有较大的风险,因此,需要开发获取外源性心脏祖细胞的方法。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)具有低免疫原性、免疫调节等优势,已作为自体/同种异体干细胞治疗的候选者。从谱系发育角度看,它和CPCs同起源于中胚层。BM-MSCs向心脏祖细胞方向诱导的重编程技术,将克服它低心脏分化潜能的缺陷,使之成为心脏修复的理想细胞类型。然而,在重编程过程中,染色质状态被认为是跨越细胞表型的最大障碍。所以,寻找新的染色质重塑因子是提高心脏祖细胞重编程效率的突破口。本研究探究AF9在蛋白质重编程BM-MSCs生成心脏祖细胞中的作用及其表观遗传调控机制。研究方法:1.将pSmartI-MLLT3表达载体,转化至大肠杆菌表达菌株中,优化AF9-His融合蛋白表达条件,利用亲和层析柱纯化AF9蛋白;2.用纳米蛋白转染载体(CN 201410823369.2)修饰重组蛋白GATA4、TBX5、NKX2.5、AF9,然后与BM-MSCs孵育12小时,免疫荧光染色观察纳米载体递送效率;3.以BM-MSCs为起始重编程对象,设置空载体组、GNT(GATA4、NKX2.5、TBX5)组和 GNTA(GATA4、NKX2.5、TBX5、AF9)重编程组。重编程第 8天,用qPCR检测各组心脏祖细胞标志性基因ISL1、FLK1、NKX2.5、GATA4 mRNA表达水平,评估AF9蛋白在获取心脏祖细胞(protein induced cardiac progenitor-like cells,piCPCs)中的作用。利用免疫荧光、流式细胞术检测重编程因子GNTA的重编程效率及piCPCs的心脏分化潜能。选取d0、d4、d8、d16四个重编程时间点,采用qPCR、Western Blot检测心脏祖细胞标志物的mRNA、蛋白质表达情况;4.利用免疫共沉淀技术和免疫荧光共定位技术检测AF9与GATA4之间的相互作用,采用Western Blot技术检测GNTA重编程过程中组蛋白甲基化修饰水平。构建shRNA-DOT1L载体以及建立稳定细胞株,用ChIP-qPCR技术检测重编程第8天CPCs标志基因MYH6、MYH7启动子区域的H3K79me2富集程度。结果:1.在BL21(DE3)菌株中成功诱导人源重组蛋白AF9表达,纯度达到90%以上;2.纳米蛋白转染试剂修饰后的重编程因子GATA4、TBX5、NKX2.5、AF9能高效转导至细胞核,效率达到95%以上;3.与GNT组相比,添加AF9蛋白能显著性提高GATA4(P0.001)、ISL1(P0.05)转录水平。BM-MSCs经GNTA诱导,8天后可见“玫瑰花环”样细胞集落形成。ISL1+/TBX5+ piCPCs 占 85.20±3.13%(n=3),诱导产生的 piCPCs具有向心肌细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞定向分化的潜能。qPCR、Western Blot结果显示,CPCs标志物随着诱导时间的延长而表达增加,其中CPCs早期标志物ISL1、NKX2.5第8天mRNA水平到达高峰。4.Co-IP结果显示AF9与GATA4存在相互作用,激光共聚焦观察到AF9和GATA4在细胞核内共定位表达。经GNTA诱导后,H3K79me2水平明显上调。shDOT1L-2载体成功沉默DOT1L的表达,显著性抑制H3K79双甲基化。ChIP-qPCR结果显示了 DOT1L的沉默,削弱了MYH MYH7启动子区域H3K79me2的富集。结论:AF9可作为有效的重编程因子,促进心脏转录因子组合GNT诱导BM-MSCs重编程为CPCs,其可能的机制是AF9招募了 DOT1L,在GATA4-AF9复合物的引导下,促进心脏关键基因启动子区域的组蛋白H3K79发生二甲基化,激活下游相关基因的表达。因此,表观遗传调控因子AF9在骨髓间充质干细胞向心脏祖细胞重编程过程起着重要的促进作用,本研究优化了蛋白质重编程因子组合,提供了一种新的、有效地获取外源心脏祖细胞的方法,为临床转化创制心肌补片、药物评价奠定研究基础。
【图文】：

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克隆子培养，提取质粒，Ａ＾ｅｌ／／／／？ｄｉｎ双酶切鉴定，环状的质粒被切断。酶切前逡逑后的质粒进行０．７％琼脂糖凝胶电泳检测，结果在１５００ｂｐ和２０００ｂｐ间可见一条逡逑清晰的片断（图１－２），推测为表达载体ｐＳｍａｒｔｌ连接的约１７３７ｂｐ的目标基因逡逑ＭＬＬ７３。将双酶切鉴定正确的ｐＳｍａｒｔＩ－ＭＬＬＴ３质粒送到英潍捷基（上海）贸易逡逑有限公司测序，部分测序结果见图１－３。经测序比对，，测序结果与预期目标基因逡逑序列１００％匹配。逡逑５，０００ｂｐ逡逑３ｔ０００ｂｐ逡逑２，Ｑ００ｂｐｌＷ逡逑１，５００ｂｐ＾＾ｌ逡逑ｌ，ＯＯＯｂｐ逡逑５００ｂｐ逡逑２５０ｂｐ＾Ｈ逡逑ｌＯＯｂｐＨ逡逑图１－２．重组质粒ｐＳｍａｒｔ丨－ＭＬＬＴ３的酶切鉴定逡逑Ｍ，邋５０００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１，酶切前质粒；２，邋ＡＷｅＩ／／＾ｄＩＩＩ邋酶切后质粒。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐＳｍａｒｔＩ－ＭＬＬＴ３邋ｐｌａｓｍｉｄｓ邋ｄｉｇｅｓｔｅｄ邋ｂｙ邋ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ逡逑ｅｎｚｙｍｅｓ逡逑Ｍ：５０００ｂｐ邋ＤＮＡ邋ｌａｄｄｅｒ．邋１，邋ｐＳｍａｒｔＩ－ＭＬＬＴ３．邋２，邋ｐＳｍａｒｔＩ－ＭＬＬＴ３邋ｄｉｇｅｓｔｅｄ邋ｗｉｔｈＡＷ＾Ｉ邋／Ｈｉｎｄｌｌｌ．逡逑１４逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54

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