Ppm1a在血管稳态维持中的功能研究

发布时间：2019-09-29 01:42

【摘要】：血管稳态维持是机体生命活动的基础。血管为机体组织供应氧和营养物质,以及将其产生的代谢废物排出体外。目前,血管疾病已成为危害人类健康的重要杀手,如何提高血管疾病的诊断及预防已成为当今人类急切需要解决的社会及科学问题。而这些疾病的病理基础都是血管结构及血管功能的异常。因此,阐明生理状态下血管结构、血管功能的调控机制以及血管疾病的发病机制将为血管疾病以及以血管病变为基础的其他诸多疾病的预防与诊断提供理论基础。尽管目前已经发现许多重要的相关基因及相关的分子机制参与血管疾病的调控。但还有待更深入的研究,因此发现血管疾病的调控基因,为血管疾病的诊断和治疗提供新靶标,将有很重要的意义。镁离子依赖的蛋白磷酸酶1A(Protein phosphatase,magnesium-dependent 1A,PPM1A)是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PPM家族的成员,具有镁离子或锰离子依赖性的单体磷酸酶。Ppm1a的底物广泛,能与众多蛋白结合使其去磷酸化,从而发挥作用。转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路参与对血管发育及血管稳态维持的调控,并在其中发挥着重要功能。许多TGF-β信号通路成员,无论是配体Tgfβ1,受体Tgfβr2、Alk1、Alk5等,还是胞内信号介导者Smads,其敲除小鼠都表现出严重血管发育缺陷。虽然遗传修饰小鼠的研究指出TGF-β信号通路的阻断会导致小鼠在胚胎期血管出现严重缺陷。然而TGF-β信号水平被过度激活后,其在血管中的功能研究以及相关的小鼠模型仍然有所欠缺。根据以往的文献报道可知,Ppm1a是TGF-β信号通路的负调控因子,Ppm1a作为蛋白磷酸酶能使P38去磷酸化抑制TGF-β信号,也能通过去磷酸化Smad2/3抑制TGF-β信号。此外,Ppm1a降低Smad蛋白水平抑制骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)信号。那么,在内皮细胞中特异性敲除Ppm1a是否能过度激活TGF-β信号?Ppm1a在血管内皮细胞中是否具有功能?本项研究通过对内皮细胞特异性敲除的Ppm1a小鼠的表型分析,探索Ppm1a在血管稳态维持中的生理功能以及其分子机制。利用实验室构建的内皮细胞特异性的Tie-Cre转基因小鼠与Ppm1a条件基因打靶小鼠交配,获得内皮细胞特异性敲除的Ppm1a小鼠。接下来,我们对内皮Ppm1a突变小鼠进行表型分析。通过对突变小鼠的观察,发现其能正常出生并存活。并对突变小鼠胚胎期的血管结构进行分析,发现并无明显异常。接着,我们对两月龄的突变小鼠的脑、主动脉、肾、肺等进行组织切片观察,结果显示与对照小鼠相比,成年条件敲除小鼠的血管结构也没有发生明显异常。内皮细胞膜结合粘蛋白Endomucin是一种糖蛋白,被认为是内皮细胞的标志物。以往的研究表明,Endomucin主要表达在小鼠胚胎血管内皮细胞、成体的静脉及微血管内皮细胞中,在成体主动脉的内皮细胞中并不表达。Endomucin具有一些生理功能,如在正常状态下,Endomucin能抑制中性粒细胞与内皮细胞的粘附,从而维持血管的稳态。而在炎症状态下,Endomucin的低表达能促进中性粒细胞与内皮细胞的粘附。通过对成体小鼠的脑、主动脉、肾、肝、心脏、肺等进行Endomucin免疫组化染色,发现内皮Ppm1a突变小鼠的主动脉内皮Endomucin表达显著增强。我们进一步对不同时间段的突变小鼠进行主动脉内膜Endomucin检测,发现出生后七天的条件基因敲除小鼠主动脉Endomucin同对照小鼠一样不表达。而出生一个月以后的突变小鼠,其主动脉内膜Endomucin持续表达。说明内皮Ppm1a突变小鼠的主动脉内皮细胞Endomucin是获得性表达。进一步我们利用免疫组化实验,对TGF-β信号通路中一些重要分子的活化水平进行检测。我们发现与对照小鼠相比,条件基因敲除小鼠主动脉内膜磷酸化Smad1/5/8的表达上调。上述结果提供体内证据表明Ppm1a可以负调控内皮细胞Smad1/5/8的活化。Smad1/5/8活化与Endomucin获得性表达具有怎样的相关性,以及Endomucin的获得性表达具有怎样的生理意义尚有待进一步研究。根据已有的文献报道可知,TGF-β信号异常激活促进内皮细胞间充质转化。我们进一步检测了内皮Ppm1a敲除小鼠的肾、肺、主动脉、脑等组织是否发生了内皮细胞间充质转化。通过Masson染色实验,与对照小鼠相比,内皮Ppm1a突变小鼠并没发生明显的纤维化,提示内皮Ppm1a突变小鼠无明显的内皮细胞间充质转化发生。此外,我们对敲除小鼠进行低氧低压应激诱导处理,与上述结果一致,经低氧低压处理的突变小鼠也无内皮细胞间充质转化发生。血脑屏障作为脑血管特化屏障结构,能够精确控制中枢神经系统和外周血中各种物质的进出,从而保持中枢神经系统微环境的高度稳定,对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。TGF-β信号通路在血脑屏障的成熟过程中发挥着重要作用。我们检测了正常情况下内皮细胞Ppm1a突变小鼠血脑屏障是否发生渗漏,与对照小鼠相比,突变小鼠在正常下并无血脑屏障的渗漏。而根据以往的文献报道可知,缺氧是众多脑血管疾病的根源,其主要是影响脑组织的血脑屏障。因此,我们也检测了在低氧低压应激诱导处理后的内皮Ppm1a敲除小鼠血脑屏障的渗漏情况,发现低氧低压应激诱导处理后内皮Ppm1a突变小鼠的血脑屏障完整性与对照小鼠相比并无明显异常。综上所述,小鼠血管内皮细胞中敲除Ppm1a,对成体重要器官包括脑、肾、肝、心脏等的血管结构无显著影响。但能使主动脉中内皮细胞Endomucin获得性表达,主动脉内皮细胞磷酸化Smad1/5/8表达上调。本研究首次系统阐述内皮细胞Ppm1a在血管发育和稳态维持中的生理功能,为血管发育与稳态维持机制的新认识提供遗传学依据。转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路与Notch信号通路在血管发育以及血管疾病的发生过程中起重要作用。在内皮细胞中,TGF-β信号通路与Notch信号通路的相互作用已被报道。此外,以往的研究发现在脑血管内皮细胞中通过TGF-β/Smad4与Notch信号通路的协同作用来维持血管的完整。之前,我们发现在Smad4缺损的内皮细胞中,Notch信号明显下调。然而,Notch受体是否作为TGF-β/Smad4信号通路下游靶分子而被TGF-β/Smad4直接调节,至今未见报道。在本项研究中,我们发现TGF-β1和骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein 4,BMP4)的刺激能在转录水平上促进Notch1和Notch4的表达。在敲低Smad4或者Notch4基因启动子Smad结合位点突变的情况下,Notch4的表达失去对TGF-β1和BMP4的反应性。综上所述,脑血管内皮细胞中Smad4介导的TGF-β/BMP信号直接上调Notch受体表达。
【图文】：

示意图,示意图,血管形成,血管发生

12图1-2 新血管出芽形成示意图[2]多种信号通路和调节分子共同调节着血管发育的各个阶段，如VEGF、Notch、Angiopoietin/Tie-2、PDGFB、TGF-β等。VEGF在血管形成中作用非常广泛。哺乳动物有5钟VEGF，其中VEGF-A是调控血管形成的主要类型。早期多次利用基因敲除小鼠的研究证明，VEGF-A杂合性缺失就会因单倍剂量不足造成小鼠心血管系统发育障碍而死于胚胎早期。VEGF通过其特异性受体VEGFR1-3发挥作用，调控内皮细胞的增殖、迁移以及内皮祖细胞的募集。在血管发生过程中，Notch信号通路通过调控Ephrin-B2和EphB4的表达，进而调控动脉-静脉分化。在顶细胞出芽过程中，Notch信号与VEGF信号被认为是调控血管出芽和生长的基本信号通路。在血管壁成熟过程中

信号通路

质的分泌等。当 TGF-β 信号通路中的组分受损时，将会导致许多人类疾病的发生，，如组织纤维化，癌症的发生和转移等[6-9]。TGF-β 信号通路通过其配体与细胞表面的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（称为 II 型和 I 型）受体结合，进而将信号传导给胞内介导者。当配体结合 II 型受体时，磷酸化特定的 I 型受体，形成异四聚体复合物，进而磷酸化及激活 SMAD 转录因子（通常称为受体调节的 SMAD 或R-SMAD）[10-12]。R-SMADs 作为 TGFβR1 激酶的底物被磷酸化后与 Co-SMAD结合形成复合物，再进入核内调节特定基因的表达，在核内其调控众多TGFβ/BMP 靶基因的转录。TGF-β 超家族的配体根据它们激活特定 SMAD 转录因子的能力，可广泛地分为两种。TGF-β 亚家族（包括 TGFβ，Acticvin 和 Nodal）激活SMAD2、SMAD3，而BMP亚家族（包括BMPs，GDFs和AMH）激活SMAD1SMAD5、SMAD8。TGF-β 亚家族的配体特异性结合 II 型受体（TGFβR-II 或TGFβR-ActR-IIB）和 I 型受体（ALK4，ALK5 或 ALK7），而 BMP 亚家族的配体特异性结合II型受体（BMPR-II或 ActR-IIA/B或AMHR-II）和I型受体（ALK1ALK2，ALK3 或 ALK6）。不同的配体结合不同的受体，从而介导不同的信号通路发生不同的反应[13]。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543

【参考文献】