盐敏感大鼠下丘脑神经元TRPV4通道对血压的中枢调节作用

发布时间：2019-10-02 20:48

【摘要】：作为心血管疾病的主要危险因素之一，盐在高血压的发病机制和治疗方法中起到了显著作用。在盐敏感高血压个体中，盐负荷过重导致的血压升高影响了60岁以上的三分之二的高血压患者。已有学者提出肾脏和中枢神经系统是两个主要的盐浓度感受部位，但具体的分子机制尚不清楚。已有模拟盐敏感高血压人群的盐敏感高血压大鼠模型—Dahl’s大鼠用以研究盐敏感高血压的分子水平的机制。随着一半以上的高血压患者为盐敏感个体，提高对降低盐敏感性的策略，尤其是在高危人群中，显得十分必要。据报道，无论是在高血压个体还是在正常血压个体，限制盐的摄入既可降低收缩压，又可降低舒张压，而在高血压个体中血压下降的幅度更大。然而，基于盐依赖的对血压的调节的分子机制仍有待于完善。目前，除了肾素-血管紧张素系统、血管平滑肌和内皮系统之外，一些内分泌、旁分泌和自分泌系统的因子也开始被重视起来。之前的研究为高盐降低盐敏感大鼠的肾脏、背根神经节和肠系膜动脉TRPV4通道的功能和表达提供了有力的证据。我们以下将探讨在盐敏感高血压大鼠神经元TRPV4通道表达和功能的变化。方法： 1.对盐敏感下丘脑大鼠神经元进行培养； 2.对大鼠下丘脑的神经元、神经胶质细胞进行免疫荧光化学染色，观察TRPV4在细胞上的存在情况； 3.应用膜片钳技术观察TRPV4通道的激动剂、拮抗剂以及高盐对盐敏感大鼠神经元动作电位的影响。 4.应用免疫印迹法检检测高盐对大鼠下丘脑TRPV4通道的蛋白表达的影响。 5.应用实时荧光定量PCR技术检测高盐对大鼠下丘脑TRPV4通道的mRNA表达的影响。 6.对室旁核脑注射TRPV4通道的激动剂和拮抗剂，评价其对循环的影响。实验结果： 1.免疫荧光染色提示SD大鼠和Dahl’S大鼠下丘脑神经元和神经胶质细胞上存在TRPV4通道提供了证据； 2. GSK使正常盐溶液和高盐溶液培养的神经元动作电位均减少：GSK在正常盐溶液培养的SD大鼠中神经元（NNSSD）和高盐溶液培养的SD大鼠中神经元（NHSSD）中，其自发性动作电位的减少无显著性差异，分别为0.518±0.035、0.382±0.049（P0.05，n=5）。GSK在正常盐溶液培养的Dahl’S大鼠神经元（NNSDS）和高盐溶液培养的Dahl’S大鼠神经元（NHSDS）中，其自发性动作电位的减少存在显著性差异，分别为0.821±0.042、0.596±0.024（P0.05,n=5）； 3. RuR使正常盐溶液和高盐溶液培养的神经元动作电位均增加：RuR在NNSSD和NHSSD中，其自发性动作电位的减少无显著性差异，分别为0.671±0.203、0.513±0.100(P0.05,n=5)。RuR在NNSDS和NHSDS中，其自发性动作电位的减少存在显著性差异，分别为2.344±0.32、1.667±0.261(P0.05,n=5)； 4.免疫印迹法检测（Western blot）大鼠下丘脑中TRPV4通道蛋白表达的改变： GAPDH作为内参，我们检测到一条约100KDa的条带，即为TRPV4通道蛋白。在下丘脑神经元和PVN组织的TRPV4通道蛋白表达中，我们得到了一致的结果。在神经元组分别为：在神经元的研究中：NNSDS组与NNSSD组相比，NNSDS组蛋白表达显著高于NNSSD组（0.860±0.251vs0.334±0.224, p0.05,n=5）；NHSDS组与NNSDS组相比，NHSDS组TRPV4蛋白表达明显低于NNSDS组（0.860±0.251vs0.395±0.251, p0.05, n=5）；而NNSSD组与NHSSD组相比，蛋白含量则无显著差异（0.334±0.224vs0.295±0.310, p0.05, n=5）。在PVN蛋白组，正常饮食组SD大鼠（SDNS）与高盐饮食组的SD大鼠（SDHS）蛋白表达无明显差异，分别为0.444±0.0.056、0.407±0.080(p0.05,n=5)；而在正常饮食组的Dahl’S大鼠（DSNS）与高盐饮食组的Dahl’S大鼠（DSHS）蛋白表达存在明显差异，分别为0.615±0.096、0.359±0.043(p0.05,n=5)。 5．在Dahl’S大鼠下丘脑神经元中，NNSDS组TPRV4mRNA表达水平显著高于NHSDS组（1.862±0.130vs1.152±0.130，n=5, p0.05）；NNSDS组TPRV4mRNA表达水平显著高于NNSSD(1.862±0.130vs1, n=5, p0.05),说明NNSDS组的TRPV4mRNA表达水平明显高于NHSDS组，高盐降低了Dahl’S大鼠下丘脑神经元的TRPV4mRNA的表达，但对SD大鼠下丘脑神经元的TRPV4mRNA的表达没有影响。在大鼠的PVN组织中TRPV4mRNA表达情况的研究中，我们得到了一致的结果，DSNS组PVN组织中TRPV4mRNA明显高于DSHS组（3.061±0.186vs0.894±0.150, p0.05, n=5）,说明高盐饮食降低了Dahl’S大鼠PVN组织中TRPV4mRNA的表达水平；而高盐饮食对SD大鼠PVN组织中TRPV4mRNA的水平则无显著影响（1.142vs1， p0.05, n=5）。 6．在PVN中TRPV4通道的活化作用：对大鼠进行GSK PVN微量注射时，与SDNS组(21.3±2.0mmHg)， SDHS组(15.9±2.8mmHg)和DSHS组(26.05±1.4mmHg)相比，DSNS组(50.3±3.6mmHg)血压下降幅度最大（P0.05，n=5)。GSK脑注射引起心率下降，在DSNS组(126.6±9.6bpm; n=5, P0.05)最为明显。SDNS组、SDHS组及DSHS组分别为(47.0±3.9bpm),(41.5±2.5bpm)和(75.4±7.8bpm)。 7．在PVN中TRPV4通道的阻断作用：将TRPV4拮抗剂RUR100nl（1mmol/L）进行脑注射时，所有组的血压立即升高，并在在4-5分钟后达到峰值。RuR的作用持续约10分钟。与其他三组相比，DSNS组的血压变化程度最大(38.8±2.2mmHg，， n=5,P0.05)，SDNS组、SDHS组和DSHS组分别升高为（18.9±2.1mmHg），（14.3±2.1mmHg）和（21.7±2.0mmHg）。心率变化在DSNS组变化最大(143±8.7bpm; n=5, P0.05)，SDNS组、SDHS组及DSHS组分别为（84.8±7.9bpm），（70.5±5.5）和（93.3±6.4bpm）。结论： 1.TRPV4通道存在于大鼠下丘脑神经元和神经胶质细胞上。 2.高盐使Dahl’S大鼠下丘脑的TRPV4通道对其激动剂及拮抗剂的反应性下降，而SD大鼠则无显著改变。 3.高盐使Dahl’S大鼠下丘脑TRPV4通道的蛋白表达降低，而对SD大鼠无显著影响。 4.高盐使Dahl’S大鼠下丘脑TRPV4通道的mRNA表达降低，而对Dahl’S大鼠无显著影响。 5.高盐饮食使PVN中TRPV4的活性下降，破坏了TRPV4通道对血压的调控作用，从而导致了Dahl’S大鼠血压升高。
【图文】：

神经元,通道,共聚焦显微镜,免疫荧光染色

第 3 章研究结果神经元染色结果大鼠神经元免疫荧光为了证明 TRPV4 通道存在于神经元和神经胶质细胞上，我们应用了 T的特异性抗体、神经元和神经胶质细胞的特异性抗体 Neun 和 GFAP。（图 1）：共聚焦显微镜下的大鼠下丘脑神经元免疫荧光染色结果：图下大鼠下丘脑神经元；图 1B 的红色部分为神经元的染色结果；图 1 C分为 TRPV4 通道的染色结果；图 1D 的黄色部分为 TRPV4 通道和神经位后的合成部分。

神经胶质细胞,免疫荧光染色,共聚焦显微镜,通道

共聚焦显微镜下的大鼠下丘脑神经胶质细胞免疫荧光染色结镜下大鼠下丘脑神经胶质细胞；B：红色部分为神经胶质细：绿色部分为 TRPV4 通道的染色结果；D：黄色部分为 TRP细胞共同定位后的合成部分。鼠神经胶质细胞免疫荧光染色：共聚焦显微镜下的大鼠下丘脑神经胶质细胞免疫荧光染色结大鼠下丘脑神经胶质细胞；图 2B 的红色部分为神经胶质细胞C 的绿色部分为 TRPV4 通道的染色结果；图 2D 的黄色部分经胶质细胞共同定位后的合成部分。免疫荧光染色结果为证于大鼠下丘脑神经元和神经胶质细胞提供了直接证据。PV4 激动剂 GSK 对神经元动作电位影响
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R544.1

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