抑制心肌组织骨桥蛋白的表达减轻扩张型心肌病小鼠心室重构以及黏着斑激酶介导骨桥蛋白诱导心脏成纤维细胞分泌I型胶原纤维的研究

发布时间：2019-10-17 15:06

【摘要】：实验目的：骨桥蛋白是体内一种多种功能的细胞因子,参与集体多种生物学活动。研究发现骨桥蛋白与心肌纤维化有着密切联系。在原发性扩张型心肌病心脏组织以及压力负荷增大而引起扩张型心肌病的心脏组织中均发现OPN表达量有异常增高。有研究报道,心肌细胞过量表达OPN能诱发扩张型心肌病的发生。黏着斑激酶是胞浆内的一种酪氨酸激酶,在细胞的迁移增殖以及生存方面起重要作用。并且参与OPN相关的的信号通路。我们实验主要目的是探究OPN在扩张型心肌病的病理,以及OPN与FAK在扩张型心肌病心肌纤维化和心肌重构中的作用。实验方法：选用自发性扩张型心肌病小鼠模型cTnTR141W转基因小鼠为实验动物。8周大小时进行开胸手术,并在心脏左心室游离壁注射载有OPN-shRNA的慢病毒,达到沉默心肌组织表达OPN的效果。实验分为3组,假手术组,仅进行手术,不注射药物。对照病毒组,注射不含shRNA的对照病毒,OPN-shRNA抑制组,注射含有OPN-shRNA的慢病毒。4周后进行小鼠超声检测评价心脏扩张程度以及左室功能。取材,提取蛋白和mRNA进行western blot以及PCR实验,以检验心脏组织Ⅰ型胶原纤维和磷酸化FAK的表达。用MASSON染色的方法检测心肌纤维化和心室重构程度。实验结果：OPN-shRNA抑制组的小鼠射血分数,左室短轴缩短率较高,收缩期左室前壁较厚,表明OPN抑制有助于扩张型心肌病的心功能改善。Masson染色显示OPN-shRNA抑制组小鼠心肌纤维化明显轻于另外两组。此外western blot, PCR结果显示OPN-shRNA抑制组的小鼠a-SMA,Ⅰ型胶原以及磷酸化FAK, Akt表达较少。实验结论：抑制扩张型心肌病心肌组织中OPN的表达,能达到减轻心肌纤维化的程度,减少心室重构,增强扩张型心肌病心脏功能的作用。黏着斑激酶(Focal Adhesion Kinase, FAK)是一种非酪氨酸激酶,在细胞信号转导中处于十分重要的位置,参与细胞运动以及细胞存活。在近年来的研究中发现,FAK与各器官的纤维化存在着重要的作用。我们假设,骨桥蛋白(osteopontin,OPN)一种与纤维化关系紧密的细胞外基质蛋白,能够刺激成纤维细胞分泌胶原蛋白,并且这一过程是经过FAK介导的。因此我们提取小鼠乳鼠心脏成纤维细胞进行试验验证这一假设,用骨桥蛋白刺激小鼠成纤维细胞,并且在刺激前12小时给予FAK抑制剂抑制FAK活性。用western blot和ELISA方法分别检测胞质内和细胞上清液Ⅰ型胶原的含量,用免疫荧光方法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA).实验结果显示,OPN能导致成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白和α平滑肌肌动蛋白,并且这种作用能被FAK抑制剂所减弱。我们得出结论,FAK能够在OPN诱导小鼠心脏成纤维细胞分化为肌成纤维细胞以及心脏的纤维化过程中起重要作用。这一发现有可能对于纤维化治疗靶点的研究有重要指导作用。
【图文】：

图２：小鼠也肌沮织０ＰＮ表达逡逑

泶锝锨浚嘌鈃笛榫谠蚧犸醪槐泶铮希桑蓿危rPㄑ粜裕]3?面积，，假手术组２．邋９６邋＋１．０２％，对照病毒组３．邋１９邋＋邋１．邋５９％邋ＶＳ．实验组０．２１邋±０．１４％，逡逑ｐ＜０．０５，图３）。这与ＰＣＲ结果（图４）保持一致，表明实验中ｓｈＲＮＡ能够对也肌组逡逑织表达０ＰＮ进行有效的抑制。逡逑假手术沮逦对照病毒组逦实验组逡逑逦（ｎ二邋６）逦（ｎ＝６）逦（ｎ＝６）逦逡逑ＢＷ（ｇ）逦２２．４３邋＋邋１．３３逦２２．６４＋１．４９逦２２．４８邋＋邋０．８７逡逑ＬＶＡＷ：ｄ逦０．８１
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.2

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本文编号：2550614