FHL1调控FAK信号通路在主动脉夹层形成中的作用机制研究

发布时间：2019-10-18 00:05

【摘要】：研究目的:主动脉中膜退化和血管平滑肌细胞功能失调是引起主动脉夹层的主要原因,细胞骨架相关蛋白four and half LIM domain 1(FHL1)蛋白在主动脉夹层中表达下调,而且下调其表达抑制了主动脉血管平滑肌的增殖。FAK(focal adhesion kinase)信号通路介导体内多信号通路,在细胞增殖、迁移和信号导方面发挥重要作用。有研究报道,FHL1间接参与了FAK介导的整合素信号通路,并且在某些疾病模型中与FAK通路的相关蛋白发生相互作用。本课题通过检测FHL1与FAK通路相关蛋白的表达及其调节细胞功能等方面展开研究,明确了FHL1与FAK信号通路在调节主动脉壁重构中相关关系,探讨了FHL1参与夹层发生发展的具体机制。研究方法:收集正常主动脉和夹层患者的主动脉组织,常规提取组织蛋白并进行蛋白定量。采用蛋白质免疫印迹(Western Blotting,WB)实验方法,检测并比较FHL1和Paxillin蛋白两组主动脉脉组织中的表达。再利用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)明确FAK相关蛋白在主动脉中的分布以及FHL1蛋白与Paxillion蛋白表达的相关性。构建并包装调控FHL1蛋白表达的腺病毒转染人主动脉血管平滑肌细胞(human aorta vascular smooth muscle cell,HASMC),采用实时定量PCR(Q-RT-PCR)检测病毒对FHL1 mRNA水平的调控,并利用Western blotting测定靶向调控FHL1表达的腺病毒对FHL1蛋白的调控效果;于此同时,采用CCK-8检测过表达FHL1蛋白与使用FAK抑制剂下调FAK表达对细胞增殖的影响。同样,采用细胞划痕实验观察过表达FHL1蛋白与使用FAK抑制剂下调FAK表达对细胞迁移的影响。构建并包装下调FHL1蛋白表达的腺相关病毒,通过尾静脉注射注入小鼠体内,用以转染小鼠主动脉,采用实时定量PCR检测和Western blotting实验分别在mRNA水平和蛋白表达水平检测腺相关病毒下调FHL1表达的效果。同时构建小鼠主动脉夹层模型,通过观察小鼠死亡率、夹层发生率和主动脉中膜的厚度,验证FHL1对夹层发生的影响结果:FHL1蛋白与Paxillin蛋白在人体主动脉组织标准中均表达低与正常人,而且Paxillin蛋白与FHL1蛋白均定位于主动脉中膜层和主动脉血管平滑肌细胞质中。靶向调控FHL1的腺病毒能有效调控mRNA水平及蛋白表达,CCK8检测上调FHL1表达,能够促进细胞增殖,而下调FAK表达可以抑制FHL1的促细胞增殖效应。细胞划痕实验结果与细胞增殖结果相似,下调FAK表达可逆反FHL1蛋白的促细胞迁移效应。靶向调控干扰FHL1表达的腺相关病毒,降低了小鼠主动脉FHL1的mRNA水平和下调了FHL1的蛋白表达。FHL1下调组小鼠的死亡率和夹层发生率都显著高于对照组,而且其中膜厚度也较对照组明显增加。结论:FHL1参与主动脉血管重塑过程可能与FAK信号通路有关,其能够通过调控FAK信号通路来促进了HASMC细胞的增殖与迁移,进而影响主动脉夹层的发生和发展。
【图文】：

图 1 BCA 蛋白定量标准曲线所示，根据标准蛋白 OD 值与已知的标准蛋白浓度获得了 BCA 蛋白定量的标准曲线和该曲线的线性方程。R2为相关系数，R2＞0.99 表示该标准曲线具有良好可行度和明显的。、

图 2AD 组与正常组主动脉组织标本靶蛋白的含量比较与正常组主动脉组织中靶蛋白（FHL1、Paxillin 蛋白）及内参蛋白 β-tu 组条带构成夹层组，右边 4 个条带为正常组，32kd、68kd、55kd 为三组
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.1

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本文编号：2550821