miR-455通过调控钙网蛋白途径对短期和长期压力负荷诱导的心肌肥厚的影响

发布时间：2019-11-11 19:42

【摘要】：背景：流行病学分析显示当今社会导致死亡的主要疾病主要为高血压,冠心病等心血管疾病,但随着医学技术与研究手段的发展,这方面的救治成功率得到了明显提高。虽然心血管病的致死率逐年降低,但它们最终的转归即慢性心力衰竭却呈现日益增加,因此救治慢性心力衰竭成为防治的重点。慢性心衰出现后心肌功能多受损,原因各有不同。慢心衰前期多会出现心肌肥厚,心肌肥厚又是导致慢性心衰的重要原因之一,二者互为因果。近年来在多种生命体内发现了一种新的小分子RNA, microRNAs,具有调节转录后的活性,更进一步又发现很多microRNAs与心肌肥厚密切相关。nicroRNAs若要发挥生物学的功能,它的基因转录产物必须经过多次酶剪切加工后形成成熟的microRNAs。过程如下最初的microRNAs经过RNA聚合酶Ⅱ转录后,首先形成初始microRNAs(Pri-microRNAs),再经Drosha剪切,变成前体microRNAs (Pre-microRNAs),有其特有的发卡结构；Pre-microRNAs从胞核转运至胞浆,此过程由Exportin-5参与,在胞浆中被Dicer酶剪切,形成双链microRNAs分子；最后,双链microRNAs分离,只有一条成为成熟的microRNAs,再与别的分子一起形成RNA诱导的沉默复合体(RISC), RISC再通过与mRNA的3’端非编码区相互作用,引起靶基因mRNA的降解或者翻译抑制,就是前面所讲在转录后负性调节蛋白质的表达。microRNAs通过转录后负性调节目的蛋白质参与许多心血管疾病。我们通过升主动脉缩窄(transverse aorta constriction,TAC)对小鼠进行短期与长期的压力负荷,建立了心肌肥厚与心力衰竭的模型,同时对实验小鼠进行miR-455的上调,旨在探讨miR-455在压力负荷心肌肥厚中的细胞与分子学机制,为预防与治疗心肌肥厚提供新的思路。第一部分miR-455通过调控钙网蛋白促进短期压力负荷心肌肥厚的心肌细胞肥大目的：最近研究显示,：microRNAs与多种心血管疾病有关,但是迄今为止并没有miRNA-455(miR-455)与心肌肥厚的研究。我们通过小鼠升主动脉缩窄(transverse aorta constriction,TAC)2周建立了心肌肥厚的模型,旨在探讨miR-455在心肌肥厚中细胞与分子学机制。方法：选用18只昆明种小鼠,随机分为手术结扎(升主动脉缩窄)+miR-455为实验组(TAC. miR-455,尾静脉注射包被miR-455的腺病毒),手术结扎+GFP为阴性对照组(TAC. GFP,尾静脉注射包被绿色荧光蛋白的腺病毒)和假手术组(Sham,尾静脉注射包被绿色荧光蛋白的腺病毒)。术后2周测量小鼠血流动力学及心脏超声数据；对心肌组织进行HE和Masson染色观察组织病理学变化；应用qRT-PCR方法检测肥大基因与纤维化基因的表达；Western blot分析凋亡蛋白；qRT-PCR与Western blot分析miR-455的靶基因和蛋白。结果：1 miR-455在小鼠体内的转染在尾静脉注射GFP的TAC后2周的小鼠体内miR-455有明显的降低,而经过尾静脉注射miR-455前体的TAC后2周的小鼠体内miR-455有明显的升高,TAC.GFP组与Sham组相比较,TAC.miR-455组与TAC.GFP组相比较均具有统计学意义(P均0.01)。2 miR-455对TAC后2周小鼠血流动力学及心脏超声和组织病理学的影响2周时,经右侧颈动脉测压显示,同Sham组比较,TAC小鼠BP和LVESP明显升高,其差值有统计学意义,但是同Sham组比较,TAC2周时LVEDP无明显变化。2周时,TAC.GFP组与Sham组比较,心肌细胞横截面积增大,心重体重比增加,LVAWd明显增加,LVIDd变小,EF增加,其差值有统计学意义(P0.05)。这些指标在TAC.miR-455组有了进一步的发展(P0.05),如心肌细胞横截面积进一步增大,心重体重比,LVAWdEF增加,LVIDd变小,但EF值2组无统计学意义(P0.05)。3 miR-455对心肌肥厚基因的影响我们评估了基因转染后心肌肥厚基因Anf, Actal和Myh7的表达。2周时和Sham组相比较,TAC.GFP组小鼠心肌组织中Anf, Actal和Myh7有明显增加(P0.01),而且在TAC.miR-455组,Anf, Actal和Myh7的表达有进一步增加(P0.01)。4 miR-455对心肌纤维化的影响2周时通过Masson染色,Sham组可见少量胶原纤维散在分布于心肌细胞间隙中,呈现蓝色,心肌细胞呈红色,我们观察到TAC.GFP组和TAC.miR-455组较之于Sham组心肌胶原纤维明显增加,但2者相比差异不明显。对于代表心肌纤维化的基因Tgfβ1和Ctgf,较之于Sham组,在TAC.GFP组和TAC.miR-455组的表达都有明显上升(P0.05),但2者比较无明显差异(P0.05)。5 miR-455对心肌细胞凋亡的影响Western blot示2周时TAC.GFP组促凋亡蛋白Bax有明显上升,TAC.miR-455组变化不明显(P0.05)o TAC.GFP组和TAC.miR-455组抗凋亡蛋白Bcl-2有所下降,但两者比较无统计学意义(P0.05)。6在TAC导致的心肌肥厚中钙网蛋白是miR-455的target gene我们进行了Calr和GRP78基因与蛋白的检测,Western blot分析,TAC.GFP组Calr和GRP78升高,但经过了miR-455的干扰,GRP78依然升高,而Calr却有了明显下降,说明Calr是miR-455的target gene之一。PCR不Calr下降同时也有Calr mRNA的下降,说明miR-455对Calr的调节是通过降低mRNA来抑制蛋白翻译。小结：短期压力负荷后小鼠出现了代偿性心肌肥厚的特征,表现为心室壁的增厚,心室腔的缩小以及心脏收缩功能的增强,出现明显心肌细胞增大,病理学出现明显心肌细胞增大。伴随出现胎儿基因的重新激活。miR-455通过降解靶mRNA,Calr降低这条途径,使得心肌细胞进一步增大,心肌肥厚更加明显。第二部分miR-455通过调控钙网蛋白减轻长期压力负荷心肌肥厚小鼠的心肌纤维化和心肌凋亡目的：心肌肥厚出现后,左心室重构进行性进展,会导致猝死、心力衰竭、心律失常等严重心脏事件。左室重构主要表现为：心肌细胞肥大、心肌凋亡增加、非心肌细胞(成肌纤维细胞),非细胞成分(胶原纤维)增加和心肌电生理以及代谢异常。我们构建了TAC后4周心力衰竭的小鼠,同时用miR-455进行干扰,以期了解miR-455对心肌纤维化和细胞凋亡的分子生物学影响及机制。方法：本研究建立了TAC 4周后的小鼠模型,并对miR-455进行干扰,测量小鼠血流动力学及心脏超声数据,对心肌组织进行HE和Masson染色观察组织病理学变化；应用PCR方法检测肥大基因与纤维化基因；TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot分析凋亡蛋白；PCR与Western blot分析miR-455的target gene与蛋白表达。结果：1 miR-455在小鼠体内的转染在尾静脉注射GFP的TAC后4周的小鼠体内miR-455有明显的降低,而经过尾静脉注射miR-455前体的TAC后4周的小鼠体内miR-455有明显的升高,TAC.GFP组与Sham组相比较,TAC.miR-455组与TAC.GFP组相比较,均具有统计学意义(P均0.01)。2 miR-455对TAC后4周小鼠血流动力学及心脏超声的影响在TAC后的4周,与TAC后2周比较,虽然BP, LVESP,心重体重比及心肌细胞横截面积无明显变化,但观察到LVEDP增高,LVAWd变薄,LVIDd变大,EF下降(P0.05),说明这些小鼠发生了明显的心肌重塑。但在TAC.miR-455组虽然LVAWd有所变薄(P0.05),但LVIDd并未见到明显的扩大(P0.05),EF也无明显下降,也就是说,经过miR-455干扰的小鼠心肌依然保持着心肌肥厚的状态。这些结果暗示出miR-455可以阻止TAC4周后的心肌重塑。3 miR-455对心肌肥厚基因的影响4周时,和Sham组相比较,TAC.GFP组和TAC.miR-455组小鼠心肌组织中Anf, Actal和Myh7有进行性上升(P0.05),但有一个现象值得注意,Myh7的表达在TAC.GFP组超过了TAC.miR-455组(P0.01)。4 miR-455对心肌纤维化的影响心肌组织切片Masson染色显示:Sham组可见少量胶原纤维散在分布于心肌细胞间隙中,呈现蓝色,心肌细胞呈红色;TAC.GFP组较之于Sham组心肌胶原纤维明显增加,而TAC.miR-455组较之于TAC.GFP组心肌胶原纤维却有显著地减少。对于代表心肌纤维化的基因Tgfβ1和Ctgf,虽然较之于Sham组,在TAC.GFP组和TAC.miR-455组的表达都有明显上升,但在4周时,Tgfβ1和Ctgf在TAC.miR-455组的表达要低于在TAC.GFP组的表达(P0.01)。说明miR-455可以减轻TAC4周后的心肌重塑。5 miR-455抑制心肌细胞凋亡经过TUNEL染色,TAC.GFP组凋亡细胞明显增多,而TAC.miR-455组凋亡细胞较之于TAC.GFP组有明显下降。通过Western blot分析,我们检测了抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax,结果显示,TAC.miR-455组较之于TAC.GFP组抗凋亡蛋白Bcl-2有显著上升,促凋亡蛋白Bax有明显下降。6在TAC导致的心肌肥厚中钙网蛋白是miR-455的target gene我们进行了Calr和GRP78基因与蛋白的检测,Western blot分析,TAC.GFP组Calr和GRP78升高,但经过了miR-455的干扰,GRP78依然升高,而Calr却有了明显下降,说明Calr是miR-455的target gene之一。PCR示Calr下降同时也有Calr mRNA的下降,说明miR-455对Calr的调节是通过降低mRNA来抑制蛋白翻译。小结：长期压力负荷后小鼠出现了失代偿心衰的特征,表现为左室舒张末期压力的明显增高,因为心室腔出现扩大影响了心脏收缩功能,左室射血分数降低,出现明显心肌纤维化和心肌细胞凋亡,同时伴随纤维化基因与凋亡蛋白的改变。若长期上调miR-455,会降解靶mRNA,使Calr降低,会减轻心肌纤维化及凋亡,减缓了心力衰竭的进程。结论：在本研究中我们得到以下结论：短期压力负荷后小鼠出现了代偿性心肌肥厚的特征,表现为心室壁的增厚,心室腔的缩小以及心脏收缩功能的增强,病理学出现明显心肌细胞增大。伴随出现胎儿基因的重新激活。miR-455通过降解靶mRNA, Calr降低这条途径,使得心肌细胞进一步增大,心肌肥厚更加明显。我们可以通过对miR-455进行调节来减轻心肌肥厚。长期压力负荷后小鼠出现了失代偿心衰的特征,表现为左室舒张末期压力的明显增高,心室腔扩大以及心脏收缩功能的降低,出现明显心肌纤维化和心肌细胞凋亡,同时伴随纤维化基因与凋亡蛋白的改变。上调miR-455降解靶mRNA,Calr降低,会减轻心肌纤维化及凋亡。因此在不同的时间段对miR-455进行不同的调控,可以减轻压力负荷导致心肌肥厚及延缓心力衰竭的进程。
【图文】：

机械压力,病理性,信号转导,家族

３也肌肥厚的信号传导逡逑ＰＢＫ／Ａｋｔ、环鸟巧酸／蛋白激酶Ｇ－１、ＭＡＰＫ等信号通路是也肌肥厚逡逑的发病机制中涉及到较为经典的传导通路。如图１。逡逑３．１肿瘤坏死因子－ａ邋（ＴＮＦ－ａ）逡逑也肌肥厚的发病机制错综复杂，研究显示正－１、化－６、ＴＮＦ－ａ等因子逡逑都参与了这一炎性综合租ｉｗｉｊ；当机体出现也肌衰弱时，根据不同的炎性、逡逑生物学反应激可发现来自淋己细胞、中性粒及巨隆细胞的ＴＮＦ－ａ的水平会逡逑发生相应的改变。如氧化应激、压力超负荷等刺激都会使ＮＦｋＢ活化，激逡逑活后的ＮＦｋＢ可转移到细胞核中，结合于ＤＮＡ中存在的ＴＮＦ－ａ启动子，接逡逑着进行转录，翻译出ｐｒｏ－ＴＮＦ－ａ，然后联合ＴＮＦ－ａ转化酶（ＴＡＣＥ）产生逡逑较为稳定的ＴＮＦ－ａ，最终引发也肌功能障碍。某些ＴＮＦ－ａ可向胞外释放，逡逑结合ＴＮＦＲ受体后，参与机体的炎症过程，激活后对也肌功能造成损伤Ｐｑ。逡逑但若ＴＮＦ－ａ水平较低则会引起一定程度的也肌保护效应
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.6

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