巨噬泡沫细胞源外泌体中microRNA调控血管平滑肌细胞增殖迁移机制研究

发布时间：2019-11-13 18:32

【摘要】：动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)是心脑血管疾病发生的病理基础,严重危害人类的健康。As发生过程中,巨噬泡沫细胞的形成发挥关键作用,血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)大量增殖、迁移,是此类疾病发生的重要病理基础。外泌体(exosomes)是一类直径大约为30~100 nm由活细胞分泌产生的膜性囊泡,其内携带多种物质,包括蛋白质、mRNA和miRNA等,exosomes内携带的功能性分子可被其他细胞摄取,从而调控细胞的基因网络,广泛参与细胞间交流。microRNA(miRNA)是真核生物中发现的一类内源性具有调控功能的非编码RNA,其大小约为23个核苷酸,进化上高度保守。通常与靶基因的3’非翻译区(3’Untranslated Region,3’UTR)互补结合,在转录后水平降解或抑制靶标mRNA,实现对靶基因的表达调控。动脉粥样硬化形成过程中,巨噬泡沫细胞形成和VSMCs大量增殖及迁移发挥重要作用,我们探究巨噬泡沫细胞与VSMCs之间能否通过exosomes进行交流,从而探究VSMCs增殖迁移新机制。我们首先通过差速离心法分离并鉴定exosomes;通过PKH67荧光标记实验验证VSMCs可以摄取巨噬泡沫细胞源exosomes;通过miRNA表达谱检测巨噬泡沫细胞源exosomes中差异表达的miRNA;以慢病毒为载体过表达或抑制miRNA并构建稳转VSMCs细胞系,探究mi RNA对VSMCs增殖及迁移能力的影响;利用生物信息学和双荧光素酶报告基因法预测并验证miRNA的靶基因。实验结果如下:1.差速离心法分离exosomes后,透射电镜观察形态,其直径介于30~100 nm之间,呈圆形或杯状囊泡形态;检测exosomes标记蛋白CD9,CD63,CD81均呈阳性表达;miRNA表达谱共筛选出188个与巨噬泡沫细胞相关的miRNAs(上调或下调大于2倍);与巨噬细胞源exosomes相比,巨噬泡沫细胞源exosomes可明显抑制VSMCs的增殖。2.利用慢病毒载体感染人主动脉VSMCs,2μg/ml嘌呤霉素筛选后建立阴性对照(NC)、miR-483过表达组(LV-miR-483)和miR-483-3p抑制组(Anti-miR-483-3p)稳转VSMCs细胞系;与NC组VSMCs相比,LV-miR-483中mi R-483-3p表达上调约48倍,说明我们成功构建稳转VSMCs细胞系。MTT法和EdU法分析细胞增殖能力,与NC组相比,LV-miR-483组VSMCs增殖能力受到抑制,Anti-miR-483-3p组VSMCs增殖能力明显增强;增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)蛋白水平呈现相同趋势。细胞划痕损伤法检测过表达miR-483-3p可显著抑制VSMCs的迁移,而Anti-mi R-483-3p组VSMCs的迁移能力受到明显抑制。表明miR-483-3p可抑制VSMCs增殖和迁移。3.利用TargetScanHuman和miRDB生物信息学软件预测miR-483-3p与细胞增殖调控相关的靶基因,发现OGT和XPO1可能为miR-483-3p靶向调控基因;双荧光素酶报告基因检测双荧光素酶-OGT 3’UTR表达载体与miR-483-3p mimics共转染组荧光素酶活性显著降低;miR-483-3p过表达组OGT蛋白水平明显下调。上述结果表明,巨噬泡沫细胞源exosomes中miR-483-3p通过靶向OGT抑制VSMCs的增殖迁移,为心血管疾病发病机制提供重要的理论依据。
【图文】：

网页,来源,脂肪斑,纤维斑块

的重要病理基础。1 动脉粥样硬化与血管平滑肌细胞As 是一类发展缓慢、过程复杂的血管炎症性疾病[1]，其主要特点是脂肪斑块和纤维斑块在内膜处积聚呈黄色粥样的斑块，致使动脉管壁增厚、管腔缩小和失去弹性，继而发生斑块破裂、血栓形成等病变。其主要发生在大、中动脉的交叉处和弯流处，吸烟、酗酒、肥胖和胆固醇等均是 As 的诱发因素。As 发生过程中，巨噬泡沫细胞的形成发挥关键作用，是 AS 的病理特征。氧化型的低密度脂蛋白(Oxidized Low Density Lipoprotein, ox-LDL)通过清道夫受体等被巨噬细胞吞噬形成泡沫细胞，构成 AS 的早期病变。As 形成包括淋巴细胞的炎症招募和血管细胞激活两个阶段，单核细胞、巨噬细胞和 VSMCs 在其形成过程中起到重要作用。

透射电镜,图片,胶片,双层脂质

置于压片暗夹的保鲜膜中，暗室中将 X 胶片压在片结束后，将 X 胶片放于显影液中，，直至出现明中 5 min，水洗晾干胶片；，拍照后，使用 Quantity Scan 软件分析条带。察 exosomes 形态结构离心的方法，分离 THP-1 细胞培养液中的 exos泡具有典型的 exosomes 特征：直径介于 30~10由于 exosomes 膜由双层脂质构成，可见中央色淡
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.5

【参考文献】