基于微流控技术的血管平滑肌细胞迁移研究
发布时间：2019-11-16 20:51
【摘要】：[目的]VSMC迁移是动脉粥样硬化和血管术后内膜增生再狭窄病理进程的关键性阶段。传统体外细胞研究模型的局限性制约了VSMC生长微环境的表征,同样降低了VSMC受调控作用的研究可信证据级别。本研究拟采用微流控技术在体外重建VSMC增殖、迁移微环境,并进一步引入高通量划痕迁移表征不同类型VSMC在不同种类／不同浓度化学诱导物条件影响下的迁移现象。与既往文献报道和传统研究方法获得的结论进行比较,解析细胞生长微环境变化对VSMC增殖、迁移的影响。有望在新细胞微环境平台上,通过对VSMC相关功能和机制开展更为深入的研究,为再狭窄防治开拓新的思路和方案。[方法]1.基于微流控技术体外重建VSMC增殖微环境,通过重力作用实现微沟道内不同衬底基质修饰(玻璃表面、多聚赖氨酸、纤连蛋白、胶原蛋白)、VSMC注入、长期培养和平滑肌肌动蛋白α-actin免疫染色。2.基于微流控技术体外重建VSMC迁移微环境,通过重力作用实现微沟道内VSMC主入、培养、划痕迁移,并定量分析不同芯片尺寸(微沟道高度100μm vs.250 μm,芯片厚度2mm vs.8mm)、不同衬底基质修饰(纤连蛋白vs.胶原蛋白)、不同细胞因子(无FBS,10%FBS,10%FBS+PDGF-BB, 10%FBS+TNF-a)、不同类型VSMC(人主动脉VSMC细胞系,人主动脉原代VSMC,鼠主动脉原代VSMC,正常内乳动脉原代VSMC,主动脉夹层病变部位原代VSMC)等条件下细胞迁移距离,比较实验结果。3.基于微流控技术可控性好、精度高等优点,通过电调控表面衬底,实现高通量实时研究细胞迁移,并定量分析不同类型VSMC (人主动脉VSMC细胞系,颈动脉粥样硬化斑块部位原代VSMC),在不同细胞因子浓度梯度(FBS, PDGF-BB, TNF-α, AngⅡ)下迁移距离,总结实验结果,探索个中规律。4.对每次拍照后的VSMC在Image Pro Plus 6.0图像处理软件中人工测量,两人背靠背,取平均值,用Microsoft 2007 excel软件录入并统计分析,实验结果用均值±标准差表示,多组问均数比较采用ANOVA检验,检验水准为a=0.05(或0.01)代表组间差异有统计学意义(或高度统计学意义)。[结果]1.通过重力作用实现了微沟道内衬底基质修饰,VSMC注入、长期培养、观察和细胞免疫染色。经过参数优化,实现了细胞在微沟道内的均匀分布(96.0±16.3/mm2)。与玻璃裸表面相比,细胞外基质(胶原蛋白、多聚赖氨酸、纤连蛋白)修饰的衬底在某个时间节点范围内可以促进VSMC的增殖和表型改变。2.比较不同的芯片几何尺寸、衬底表面修饰、细胞因子对VSMC迁移的影响,结果表明,1)微沟道高度对细胞迁移有显著作用;2)与纤连蛋白相比,片上修饰胶原蛋白更能促进细胞迁移;3)FBS、PDGF-BB、TNF-α均能促进细胞迁移。另外,还量化了五种类型VSMC(人VSMC细胞系、人和鼠原代VSMC、两例患者样本分离培养得到的原代VSMC)的迁移能力,发现人细胞系和患者样本的细胞迁移距离可比拟,但是显著少于人和鼠原代细胞。3.基于高通量、可控性好的384孔划痕迁移方法,结果表明,1)随着FBS浓度升高,VSMC迁移距离增加,证实该大序列划痕迁移技术的可行性；2)随着PDGF-BB农度升高,人VSMC细胞系迁移距离增加,但是没有饱和的趋势;3)随着PDGF-BB农度升高,产生迁移的动脉粥样硬化斑块部位原代VSMC个数上升,并在200ng/ml的位置出现峰值,之后又开始下降;4)随着TNF-α浓度升高,产生迁移的动脉粥样硬化斑块部位原代VSMC个数无明显变化;5)随着AngⅡ浓度升高,产生迁移的动脉粥样硬化斑块部位原代VSMC个数有下降趋势。[结论]1.基于微流控技术体外重建VSMC增殖微环境,该新型平台技术开发了VSMC研究系列中新的VSMC培养模式。2.基于微流控技术体外重建VSMC迁移微环境,该新型平台技术开发了VSMC研究系列中新的VSMC迁移模型。3.基于微流控技术实现VSMC大序列划痕迁移,该新型平台技术开发了一种高通量,自动化,适于实时观察分析的研究模型。
【图文】：
养微沟道阳模的方形塑料皿内：真空腔室抽气３０分钟Ｗ上，观察表面，直至没逡逑有气泡为止；放入烘箱？调平，加热ＰＤＭＳ使之固化（８０°邋Ｃ，至少１０小时），逡逑如图２中子图ＩＶ所示。逡逑ＰＤＭＳ模具剥离、清洗：将ＰＤＭＳ从方形皿中取出，然后将ＰＤＭＳ从玻片逡逑上剥离，并将玻片背面的巧巧撕下来尲在正面，防止沟道内落入灰尘：沿着玻片逡逑印迹切出长方形器件，，边缘切割整齐，表面平整，使其小于玻片，边缘突起也要逡逑切掉；使用直径４ｍｍ打孔器对准器件上的圆形注入孔打孔（器件的沟道面朝上，逡逑下面垫上一层厚无尘纸），使完全洞穿，拔掉孔内ＰＤＭＳ；透明胶带粘贴ＰＤＭＳ逡逑器件表面１０次，清除杂质；放入乙巧超声５分钟，更换乙醇？再次超声，重复逡逑３次（功率、频率均调至最大
吸出每个沟道两入口处的旧培养基，并在两入口同时注入２０叫新鲜培养基，为逡逑片上ＶＳＭＣ提供必需的营养物质，直至培养７２小时，并在盈微镜下拍照记录逡逑ＶＳＭＣ数量、形态（图３中子图６）。注意同时加入相同液量培养基的目的是最逡逑大程度减少微沟道内流体剪切力对ＶＳＭＣX椫场⒈硇偷挠跋臁ｅ义掀希郑樱停缅澹幔幔悖簦椋钕赴庖呷旧好看味际褂昧桨岩埔呵梗玻敖校保敖幸哄义狭坎罨灰骸Ｎ鼍膳嘌矗ザ嗑奂姿峁潭ǎ保捣种樱挥茫校拢优渲茫常サ乃跛义戏獗找海獗眨保捣种樱河们桑优渲没常サ模裕颍榛睿兀保埃巴改ひ和改ぃ保捣种樱″义嫌茫校拢优渲茫保埃ド窖蜓澹常
本文编号：2561993
【图文】：
养微沟道阳模的方形塑料皿内：真空腔室抽气３０分钟Ｗ上，观察表面，直至没逡逑有气泡为止；放入烘箱？调平，加热ＰＤＭＳ使之固化（８０°邋Ｃ，至少１０小时），逡逑如图２中子图ＩＶ所示。逡逑ＰＤＭＳ模具剥离、清洗：将ＰＤＭＳ从方形皿中取出，然后将ＰＤＭＳ从玻片逡逑上剥离，并将玻片背面的巧巧撕下来尲在正面，防止沟道内落入灰尘：沿着玻片逡逑印迹切出长方形器件，，边缘切割整齐，表面平整，使其小于玻片，边缘突起也要逡逑切掉；使用直径４ｍｍ打孔器对准器件上的圆形注入孔打孔（器件的沟道面朝上，逡逑下面垫上一层厚无尘纸），使完全洞穿，拔掉孔内ＰＤＭＳ；透明胶带粘贴ＰＤＭＳ逡逑器件表面１０次，清除杂质；放入乙巧超声５分钟，更换乙醇？再次超声，重复逡逑３次（功率、频率均调至最大
吸出每个沟道两入口处的旧培养基，并在两入口同时注入２０叫新鲜培养基，为逡逑片上ＶＳＭＣ提供必需的营养物质，直至培养７２小时，并在盈微镜下拍照记录逡逑ＶＳＭＣ数量、形态（图３中子图６）。注意同时加入相同液量培养基的目的是最逡逑大程度减少微沟道内流体剪切力对ＶＳＭＣX椫场⒈硇偷挠跋臁ｅ义掀希郑樱停缅澹幔幔悖簦椋钕赴庖呷旧好看味际褂昧桨岩埔呵梗玻敖校保敖幸哄义狭坎罨灰骸Ｎ鼍膳嘌矗ザ嗑奂姿峁潭ǎ保捣种樱挥茫校拢优渲茫常サ乃跛义戏獗找海獗眨保捣种樱河们桑优渲没常サ模裕颍榛睿兀保埃巴改ひ和改ぃ保捣种樱″义嫌茫校拢优渲茫保埃ド窖蜓澹常
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