microRNAs调控FABP1基因表达机制研究

发布时间：2019-11-27 06:16

【摘要】：目的:人肝型脂肪酸结合蛋白(Human liver fatty acid binding protein,FABP1)是一组分子量约为14~15KD,并能与长链脂肪酸结合的高保守性蛋白,是脂肪酸结合蛋白家族成员之一。本实验室前期研究表明肝细胞核因子3β(hepatocyte nuclear factor 3β,HNF3β)和CCAAT/增强结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)作用于FABP1基因的启动子调控其表达,但是3’末端非翻译区(3’untranslational region,3’UTR)的调控机制尚不清楚。本研究旨在深入探讨mi RNA对FABP1-3’UTR表达的影响,从而深入探讨肝细胞脂肪化的机制,有助于为脂肪肝的诊断治疗提供新的诊治方向。方法:1.运用PicTar、Target Scan等软件进行生物信息学分析FABP1相关的mi RNAs,筛选出可能靶向FABP1-3’UTR的mi RNAs。2.化学合成FABP1-3’UTR,连接于pmir GLO载体,构建重组载体pmir GLO-FABP1-3’UTR,通过脂质体介导将软件预测的mi RNA mimics或阴性对照(Negative Control,NC)与pmir GLO-FABP1-3’UTR重组载体分别共转染Hep G2细胞中,转染48 h后,通过双荧光素酶报告基因检测系统进行荧光素酶活性检测,与对照组相比,筛选出可能作用于FABP1-3’UTR的mi RNAs。3.找到初步筛选出来的mi RNAs与FABP1-3’UTR的配对碱基,突变配对碱基,化学合成pmir GLO-FABP1-3’UTRmuts,由脂质体介导与相应mi RNA mimics共转染Hep G2细胞,48h后,通过双荧光素酶报告基因检测系统进行荧光素酶活性检测,进行复筛。4.进一步采用荧光定量PCR和western-blot方法检测mi RNAs对FABP1 m RNA和蛋白表达的影响。结果:通过软件预测及数据库分析,筛选出68条可能靶向FABP1-3’UTR的mi RNAs。将以上筛选出mi RNA mimics与pmir GLO-FABP1-3’UTR重组载体分别共转入Hep G2细胞,48h后,与对照组相比,荧光素酶活性检测显示有16个mi RNAs能明显降低荧光素酶值(t检验分析,P0.05)。且在复筛中发现,其中6个mi RNAs相对应的突变体能够回复这种下调作用,即有6个mi RNAs能够下调FABP1-3’UTR的表达,分别为:mi R-323a-3p、mi R-362-3p、mi R-4672、i R-466、mi R-3941、mi R-4517。以GAPDH为realtime逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)内参,实验结果表明部分mi RNAs对FABP1在mRNA表达水平没有影响甚至上调,部分下调FABP1的表达:mi R-323a-3p、mi R-362-3p、mi R-4672。以β-actin为western blot内参,结果显示mi RNAs均能够不同程度的下调FABP1蛋白水平表达。结论:6个mi RNAs能通过作用于FABP1的3’UTR在转录后水平负调控FABP1基因的表达,影响FABP1的正常表达,导致一系列生理病理变化。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2

【参考文献】