PI3K在肌凝蛋白诱导的小鼠自身免疫性心肌炎中的作用及其机制研究

发布时间：2020-02-13 16:57

【摘要】：第一部分肌凝蛋白诱导小鼠产生自身免疫性心肌炎模型的构建背景心血管疾病因为发病率高,致死率高,严重威胁着人类的健康。全球每年有超过1730万人死于各类心血管疾病,这其中有2%的是各种心脏炎症性疾病。心肌炎临床症状多样,许多会发展成扩张性心肌病。多种感染性因素和非感染性因素均可诱发心肌炎,但是到目前为止,心肌炎的病因尚不清楚,临床上对心肌炎的发生和进展缺乏有效的干预手段。研究表明,持续的免疫应答在心肌炎的进展过程中起着重要的促进作用。多种动物模型被用来研究心肌炎。稳定、可靠的动物模型对于探讨自身免疫性心肌炎的发病机制非常重要。目的验证肌凝蛋白诱导法建立小鼠自身免疫性心肌炎模型的稳定性、可靠性和应用价值。方法小鼠皮下注射啮齿类动物心脏肌凝蛋白与完全弗氏佐剂混合物诱导自身免疫性心肌炎。小鼠分组：取40只8-12周龄BALB/C野生型小鼠,按随机分组原则将小鼠分为4组,具体分组如下：空白对照组(A)：雌性BALB/C小鼠10只不加任何处理。低浓度EAM模型组(B)：雌性BALB/C小鼠10只,啮齿类动物心肌肌凝蛋白重链氨基酸片段与弗氏佐剂混合物25μg/200μl。中浓度EAM模型组(C)：雌性BALB/C小鼠10只,啮齿类动物心肌肌凝蛋白重链氨基酸片段与弗氏佐剂混合物50μg/200pl。高浓度EAM模型组(D)：雌性BALB/C小鼠10只,啮齿类动物心肌肌凝蛋白重链氨基酸片段与弗氏佐剂混合物100μ,g/200μl。EAM组小鼠注射氨基酸-弗氏佐剂混合物,空白对照组同样部位注射PBS。与对照组小鼠比较心肌炎的发生率、心脏质量/体重的比值、心脏病理学改变。结果小鼠心肌质量/体重以及心肌病理学改变呈浓度依赖性增加,正常对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组心肌炎的发生率分别为0/10、2/10、5/10、10/10,心脏质量/体重比例(mg/g)分别为5.53±0.21、6.16±0.32、7.04±0.53、8.16±0.87。病理学检查是评价心肌炎症及纤维化程度的首选方法,也是评价EAM模型的金标准,四组小鼠心肌形态学评分分别为0、1.7±0.3、2.2±0.4、2.9±0.6,表明小鼠注射肌凝蛋白重链氨基酸片段(MyHC-α与CEA混合物,浓度在25μg/200μl-100μg/200μl的范围内)后,成功的诱导小鼠产生了心肌炎。结论肌凝蛋白诱导法能很好地模拟自身免疫性心肌炎,可用于探讨自身免疫性心肌炎的机制。MyHC-α与CEA混合物浓度在100μg/200μl浓度时小鼠心肌炎发病率高,炎症反应典型,是最合适的处理浓度。第二部分PI3K在肌凝蛋白诱导的自身免疫性心肌炎小鼠心肌病理损伤中的作用背景BALB/C小鼠对a-肌凝蛋白或肌凝蛋白重链来源的氨基酸序列敏感性高,利用α-肌凝蛋白或肌凝蛋白重链来源的氨基酸免疫BALB/C小鼠,可以诱导小鼠自身免疫性心脏病,是自身免疫性心肌炎常用的动物模型,我们前面的研究已经证实肌凝蛋白诱导法能建立稳定、可靠的自身免疫性心肌炎动物模型。慢性自身免疫性反应是介导心肌炎发生发展的重要分子机制,然而到目前为止,介导该过程的具体分子机制依然不清楚,临床依然缺乏有效的治疗策略。磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphoinositide 3-kinase, PI3K)是炎症免疫应答调节中非常重要的蛋白激酶。最近几年越来越多的研究发现PI3K在多种自身免疫性疾病中发挥重要作用,但是PI3K是否在自身免疫性心肌炎的发生、发展中起作用还未得知。目的利用药理学的方法抑制PI3K的活性,观察肌凝蛋白诱导的实验性自身免疫性心肌炎小鼠心肌损伤的变化,从而明确PI3K在实验性自身免疫性心肌炎中的作用。方法为排除LY294002对生理状态下小鼠的影响,我们首先检测LY294002毒理作用。小鼠皮下注射啮齿类动物心脏肌凝蛋白与完全弗氏佐剂混合物诱导自身免疫性心肌炎。小鼠分为三组,空白组、对照组(EAM组)和实验组(EAM+LY组)。实验组小鼠腹腔注射PI3K抑制剂LY294002,观察PI3K活性被抑制后,与对照组小鼠比较心肌炎的发生率、心脏质量／体重的比值、心脏病理学改变以及小鼠死亡率的变化。结果LY294002的毒理检测结果表明,生理状态下的小鼠在给予实验中所用剂量的LY294002后,心脏、肝脏、肾脏、肺等脏器没有发生可见的病理学损伤。小鼠注射肌凝蛋白重链氨基酸片段后,发生了严重的心肌炎细胞浸润以及心肌坏死,心脏质量/体重比例较正常小鼠增加(8.16±0.87 vs5.53±0.21,p0.01)小鼠死亡率高(8/10)。而给予PI3K抑制剂LY294002干预后,实验组小鼠的心脏/体重比例明显比对照组降低(6.04±1.03 vs 8.16±0.87,p0.05)。小鼠心肌炎性损伤明显减轻(形态学损伤评分1.7+0.6 vs 2.9±0.6,p0.01)。小鼠的7天死亡率较对照组明显降低(3/10 vs 8/10)。结论抑制PI3K对实验性自身免疫性心肌炎造成的心肌损伤具有保护作用,提示PI3K信号通路可能是治疗自身免疫性心肌炎的潜在靶点。第三部分PI3K在肌凝蛋白诱导的自身免疫性心肌炎小鼠心肌炎症反应和免疫反应中的作用背景促炎细胞因子的释放是炎症反应非常重要的调节机制,目前已有多篇文献报道IL-1p、TNF-α和IFN-γ等促炎因子分泌增加与自身免疫性心肌病的发病和进展密切相关。趋化因子招募炎症细胞浸润病变部位需要激活PI3K/AKT信号通路,AKT属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是PI3K下游最重要的信号转导蛋白。我们前面的研究已经证明PI3K药理学活性的抑制可以缓解心肌肌凝蛋白重链氨基酸片段(MyHC-α)诱导的心肌病理损伤并且可明显降低小鼠的死亡率,说明了PI3K的激活介导了自身免疫性心肌炎的发生过程中。但是PI3K是如何调节心肌炎的发生的过程依然不清楚。目的探讨PI3K信号通路在肌凝蛋白诱导的自身免疫性心肌炎进展过程中对炎症反应的调节作用,进而揭示P13K介导自身免疫性心肌炎的分子机制。方法采用免疫组织化学方法检测空白对照组、EAM组以及EAM+LY294002组小鼠心肌中细胞免疫应答相关的CD3+T细胞的数目,利用western blotting分析上述各组小鼠心肌内PI3K下游信号转导蛋白AKT磷酸化水平。取正常小鼠心脏旁淋巴细胞体外培养,分空白对照组,EAM组、EAM+低浓度LY294002组以及EAM+高浓度LY294002组,采用流式细胞术检测上述各组淋巴细胞中CD4+和CD8+T细胞的绝对值及二者的比例。采用ELISA的技术分别检测各组小鼠血清中及各组培养的淋巴细胞释放的TNF-α、IL-1β和IFN-γ等炎症因子。结果通过免疫组化检测结果我们观察到在EAM小鼠心脏组织切片CD3染色呈强阳性,而在空白组和EAM+LY294002组,CD3染色不明显。流式细胞术显示,肌凝蛋白的应用使得CD4+和CD8+T细胞的绝对值分别较空白对照组增加(24.3% vs23.22%和11.95% vs 9.36%)。而应用1 μM LY预处理细胞后,CD4+和CD8+T细胞的绝对值较EAM组均有所下降(24.05% vs24.3%和7.44% vs 11.95%)；应用15μ M LY预处理细胞后,CD4+和CD8+T细胞的绝对值较EAM模型组小鼠有更明显的下降(21.37% vs24.3%和7.19% vs 11.95%)。肌凝蛋白的应用使CD4+/CD8+T细胞比例较空白对照组降低(2.03 vs 2.48),1 μM和15μ M的LY294002分别使得CD4+/CD8+T细胞的比例达到3.23和2.97。western blotting分析结果显示小鼠腹腔注射LY294002后,由肌凝蛋白诱导的AKT磷酸化水平下降(0.71±0.12 vs1.14±0.21)。ELISA分析结果提示,小鼠血清中促炎因子的含量较正常对照小鼠相比,表达水平明显升高(TNF-α、IL-1β和IFN-γ3种炎症因子与对照组相比分别为：174±24.21 vs 48.2±1.52；18.2±1.87 vs 4.07±0.74；220±29.4 vs 40.43±2.34),但是LY294002预处理小鼠血清中促炎因子的含量升高水平并不明显(3种炎症因子与EAM相比分别为：119±4.03 vs 174±24.21；11.5±1.56 vs 18.2±1.87；170±6.43 vs 220±29.4)。细胞实验中,培养的淋巴细胞受MyHC-α刺激3h后,TNFα、IL-1β和IFN γ等促炎因子的表达量显著升高(刺激组3种炎症因子与对照组相比分别为：78±11.73 vs 19.8±2.23；47.8±5.17 vs 12.3±1.36；92.8±5.27vs 8.23±1.44)。但是如果在加MyHC-α刺激之前,给予细胞LY294002的预处理,促炎因子的表达量依赖性地被抑制了(最大剂量干预组3种炎症因子与单独刺激相比分别为：30±1.78 vs 78±11.73；17.6±1.46 vs 47.8±5.17；22±1.77 vs92.8±5.27)。结论抑制PI3K可以明显改善啮齿类动物心肌肌凝蛋白诱导的小鼠实验性自身免疫性心肌组织中的炎症反应以及适应性免疫细胞的比例失衡,说明PI3K有可能是通过促进心肌炎中的炎症反应以及免疫反应进在实验性自身免疫性心肌炎的心肌损伤中发挥作用。第四部分PI3K在肌凝蛋白诱导的小鼠自身免疫性心肌炎心肌细胞凋亡中的作用背景有研究表明心肌细胞的凋亡在心肌炎的病理进程中发挥了独立的作用。Bax、Bim和Bcl-2同属于Bcl-2蛋白家族成员,而Bax和Bim主要发挥促凋亡的作用,而Bcl-2发挥的是抗凋亡的作用。Bax很久之前就已经被证实可以被Bim直接激活,触发细胞色素C的释放,促进caspase瀑布级联反应的激活,诱发细胞的凋亡.caspase属于半胱氨酸蛋白酶家族,其中caspase-3是诱导细胞凋亡的执行蛋白质,而caspase-9是诱导细胞凋亡的启动蛋白.我们前面的研究表明PI3K通过促进心肌炎中的炎症反应以及免疫反应进在实验性自身免疫性心肌炎的心肌损伤中发挥作用,但是P13K/AKT/mTOR细胞通路是否参与自身免疫性心肌炎的心肌细胞凋亡过程并未研究明了。目的在抑制PI3K后,观察自身免疫性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的情况,进而探讨PI3K信号通路对肌凝蛋白诱导的小鼠自身免疫性心肌炎发病过程中心肌细胞凋亡的调节作用。方法利用western blotting的技术检测空白对照组、EAM组、EAM+LY294002组小鼠心脏中P13K/AKT/mTOR信号通路中p85(PI3K亚基)、AKT和mTOR蛋白的磷酸化水平。通过免疫印迹和EMSA技术检测三组小鼠心肌细胞核内P65(NFκB亚基)的表达。利用TUNEL染色,观察三组小鼠心肌细胞的凋亡情况,并采用western blotting技术和RT-PCR技术分析凋亡相关蛋白质Bax、Bim、caspase3和Bcl-2的表达。结果小鼠腹腔注射PI3K抑制剂LY294002后,较同型实验组小鼠,P13K/AKT/ mTOR信号通路的活性明显下降,NF-κB的活性降低,凋亡相关蛋白Bax、Bim、caspase3的mRNA的含量明显增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA的表达量被抑制。EAM+LY294002组与EAM组相比,P13K/AKT/mTOR信号通路的活性明显下降(p85、AKT和mTOR蛋白3种指标磷酸化水平分别为：3.7±0.23 vs 6.2±0.18；2.18±3.50 vs 5.93±1.26；0.69±0.18 vs 2.32±0.34)。心肌细胞核蛋白质western blotting和EMSA的结果显示,LY294002+EAM组与EAM组相比NF-κB的活性降低超过55%(核P65水平分别为：0.42±0.10 vs 1.2±0.16)。TUNEL技术显示,LY294002+EAM组与EAM组相比,心肌细胞凋亡数目激增。western blotting技术分析显示,LY294002+EAM组与EAM组相比,小鼠心肌中的Bax、Bim、caspase3和Bcl-2的表达量分别为：2.1±0.20 vs 1.25±0.24；2.2±0.05 vs 0.7±0.06；1.9±0.29vs 1.25±0.20；0.30±0.03 vs 0.92±0.21。RT-PCR的结果显示：LY294002+EAM组与EAM组相比,Bax、Bim、caspase3和Bcl-2 mRNA的表达量分别为：1.0±0.21vs 0.56±0.01；1.75±0.27 vs 0.8±0.22；2.4±0.26 vs 1.2±0.01；0.6±0.21 vs0.9±0.09。结论抑制PI3K通路可以增加促凋亡相关蛋白的表达,并抑制抗凋亡相关蛋白的表达,最终可以促进亚急性和慢性心肌炎小鼠心肌细胞的凋亡。表明PI3K通路在EAM小鼠心肌细胞的凋亡中起负向调节作用。
【图文】：

病理形态,肌炎,浓度,肌凝蛋白

逡逑图１．１Ａ：实验组、低浓度ＥＡＭ组、中浓度ＥＡＭ组、高浓度ＥＡＭ组小鼠的生存曲逡逑线，肌凝蛋白浓度越高，小鼠死亡率越高Ｂ：实验组、低浓度ＥＡＭ组、中浓度ＥＡＭ逡逑组、高浓度ＥＡＭ组小鼠屯、肌质量／体重随肌凝蛋白浓度增高而增大逡逑■灥逡逑图１．２：ＨＥ染色检测Ａ（正常对照组），Ｂ（低浓度ＥＡＭ组），Ｃ忡浓度ＥＡＭ组），Ｄ（高浓逡逑度ＥＡＭ组）的病理形态（Ｘ２００）逡逑讨论逡逑多种因素能导致也肌炎的产生，包括感染性和非感染性剂，，如病毒，细茵，逡逑原生动物，真菌，毒素Ｗ。屯、肌炎的临床表现Ｗ及病理改变是多种多样的，这造成逡逑了屯、肌炎的临床研究非常困难，由于这些因素引起的临床症状的多样性，屯、肌炎逡逑的诊断仍然是具有挑战性的ｔｗｉ。屯、肌炎可Ｗ通过组织学，免疫学，免疫姐织化学逡逑的手段来诊断。但要确定屯、肌炎，需进行必内膜屯、肌活检（ＥＭＢ）和分子生物学逡逑技术

毒理学,小鼠,肌炎

图２．１邋ＬＹ２９４００２在小鼠体内的毒理学分析。逡逑ＢＡＬＢ／ｃ小鼠连续四周每天注射ＬＹ２９４００２邋（浓度４０山体积１０叫），然分离小鼠也脏、肝脏、肾脏和肺进行ＨＥ染色，１００倍镜下观察四种组织的病理变化。每个实验结果进行Ｈ次独立实验。逡逑二、ＬＹ２９４００２在自身免疫性心肌炎中的治疗作用逡逑ｌ．ＭｙＨＣ－ａ诱导实验性自身性心肌炎的作用逡逑小鼠皮下注射晒齿类动物屯、肌肌凝蛋白重链氨基酸片段（ＭｙＨＣ－ａ）和弗氏剂（ＣＦＡ）的混合乳是诱导小鼠实验性自身免疫性也肌炎的经典方法。我们采用逡逑双次免疫的方法，在初次免疫后４周观察小鼠罹患屯、肌炎的情况。结果显示，皮注射ＭｙＨＣ－ａ４周后可见发病率极高的小鼠严重的屯、肌炎（表２．１）。小鼠屯、脏质／体积比的增加提示小鼠屯、肌病的发生，在ＭｙＨＣ－ａ诱导的小鼠也肌炎中，我们检测逡逑至ＩＪ，小鼠的有较重的也、肌病发生，但是ＬＹ２９４００２的使用可Ｗ改善这种现象（表２．１）。逡逑
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.21

【参考文献】