二氢辣椒碱通过NFIA-NF-κB途径抑制促炎因子的表达

发布时间：2020-03-12 04:47

【摘要】：背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是影响人类健康的一种全身性的慢性疾病,其主要临床并发症如中风、心肌梗死、心衰等的发病率正逐年上升。研究已表明,炎症反应贯穿了 AS发生发展的全部阶段,包括从斑块的形成到破裂。但目前针对AS的治疗仍主要集中于降低血清中的脂质水平。近年来针对AS过程中的炎症介质的治疗正逐渐增多。二氢辣椒碱(dihydrocapsaicin,DHC)是从红辣椒中提取的辛辣成分之一,具有镇痛、抗癌、抗氧化等多种药理和生理学作用。本课题组前期研究发现,DHC能够通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)/人肝 X 受体 α(Liver X Receptor α,LXRα)通路减少高脂饮食条件下apoE-/-基因敲除小鼠斑块的形成,同时下调小鼠体内促炎因子表达水平。同时本课题组还发现在HepG2细胞系中DHC能够通过抑制叉头框蛋白a2(forkhead box a2,Foxa2)并增强LXRα的表达从而下调载脂蛋白M(apolipoprotein M,apoM)的表达。因此,DHC具有预防心血管疾病特别是抗AS的作用。但是有关DHC对于炎症方面的具体影响目前仍未可知,DHC影响促炎因子表达的具体机制也尚不明确。结果1、DHC能够上调NFIA的表达并抑制NF-κB和促炎因子的表达本研究发现,在转录水平和蛋白水平上,DHC均能够浓度依赖性地上调THP-1巨噬细胞中核转录因子IA(nuclear factor IA,NFIA)的表达并抑制核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的表达。利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导了 THP-1 巨噬细胞肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β及IL-6分泌的增多,而DHC抑制了细胞对于这些促炎因子的分泌。将apoE-/-基因敲除小鼠随机分为DHC组和对照组,并分别经口腔灌胃给药DHC或无胆固醇植物油。免疫组化检测发现,与对照组相比,实验组小鼠主动脉窦部位NFIA表达上调而NF-κB的表达下调,同时免疫印迹结果显示主动脉组织中TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白水平均有所下调。2、NFIA能够抑制NF-κB及促炎因子的表达通过慢病毒过表达NFIA后,THP-1巨噬细胞中NF-κB水平下调。利用LPS诱导THP-1巨噬细胞促炎因子分泌,过表达NFIA后,培养基中细胞分泌的促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6表达水平相较于单纯LPS诱导组有所下调。体内实验发现,经慢病毒过表达NFIA的apoE-/-小鼠主动脉窦部位NF-κB表达水平较低,同样主动脉组织中促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6的表达也低于对照组。3、DHC通过增强NFIA抑制了 NF-κB的表达及活性,并最终抑制了促炎因子的表达免疫印迹结果显示,DHC能够下调THP-1巨噬细胞中NF-κB的表达,而通过慢病毒过表达NFIA后,DHC导致的NF-κB的下调作用有所增强。DHC能够上调NF-κB抑制剂(inhibitor of NF-κB,IκB)α的表达,同时过表达NFIA后,DHC对IκBα的上调作用更为增强。DHC抑制了 NF-κB的活性,同时过表达NFIA后,DHC抑制NF-κB活性的效应更为显著。同样,在THP-1巨噬细胞中,过表达NFIA后DHC对于促炎因子释放的抑制效应更为明显。过表达NFIA的同时采用小分子RNA干扰技术敲减NF-κB的水平,我们发现NFIA对促炎因子释放的抑制作用更为显著,因此NF-κB可能参与了 NFIA对于促炎因子的调控。最后,我们通过小鼠体内实验也证实了过表达NFIA后能够增强DHC对于小鼠血清中促炎因子表达的抑制作用。结论DHC能够通过增强NFIA进而抑制NF-κB的表达及活性,并最终抑制促炎因子的分泌。本研究发现了 DHC影响促炎因子分泌的分子机制,为DHC作为治疗AS等炎症性疾病药物提供了一定的理论基础。
【图文】：

巨噬细胞,浓度依赖性,炎症模型

２４小时后，检测ＮＦＩＡｍＲＮＡ水平及蛋白水平是否发生变化。ｑＲＴ－ＰＣＲ逡逑结果显示，ＤＨＣ能够浓度依赖性地上调ＴＨＰ－１细胞中ＮＦＩＡ的表达含量；同样，逡逑免疫印迹结果显示，ＤＨＣ也能够使蛋白水平产生相应变化（图１－１）。同时，我逡逑们还检测了邋ＤＨＣ不同浓度梯度作用下的ＴＨＰ－１巨噬细胞中ＮＦ－ｋＢ的ｍＲＮＡ及逡逑蛋白水平是否发生变化，如图１－２所示，ＤＨＣ同样能够浓度依赖性地下调ＮＦ－ｋＢ逡逑的ｍＲＮＡ及蛋白水平的表达。为探宄ＤＨＣ对促炎因子分泌的影响，我们采用逡逑ＬＰＳ诱导ＴＨＰ－１巨噬细胞的方式构建炎症模型。将ＴＨＰ－１巨噬细胞分为三组，逡逑分别为对照组、ｌＯｎｇ／ｍＬ邋ＬＰＳ刺激及ｌＯＯ＾Ｍ邋ＤＨＣ加１０ｎｇ／ｍＬ邋ＬＰＳ三种处理方逡逑式，于３７°Ｃ环境中培养２４小时后，采用ＥＬＩＳＡ法检测细胞上清中ＴＮＦ－ｏｕ邋ＩＬ－１Ｐ逡逑和ＩＬ－６的表达水平。结果显示，和对照组相比，ＬＰＳ刺激后细胞上清中ＴＮＦ－ｏｕ逡逑３２逡逑

过表达,巨噬细胞,慢病毒

我们首先采用慢病毒过表达ＴＨＰ－１细胞中ＮＦＩＡ的水平。将ＴＨＰ－１细胞逡逑分别转染慢病毒过表达载体（ＬＶ－ＮＦＩＡ）和慢病毒空载体（ＬＶ－Ｍｏｃｋ），并加入逡逑ＰＭＡ进一步诱导为巨噬细胞，提取相应细胞蛋白进行免疫印迹实验。如图２－１逡逑结果显示，与ＬＶ－Ｍｏｃｋ组相比，ＬＶ－ＮＦＩＡ组细胞中ＮＦ－ｋＢ表达水平明显下调；逡逑另外设立三组，分别为转染了邋ＬＶ－Ｍｏｃｋ的ＴＨＰ－１巨噬细胞加ＰＢＳ处理（Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑组），转染了邋ＬＶ－Ｍｏｃｋ的ＴＨＰ－１巨噬细胞加１０ｎｇ／ｍＬＬＰＳ处理（ＬＰＳ组），转染逡逑了邋ＬＶ－ＮＦＩＡ邋的邋ＴＨＰ－１邋巨噬细胞加邋１０ｎｇ／ｍＬ邋ＬＰＳ邋处理（ＬＶ－ＮＦＩＡ＋ＬＰＳ邋组），２４ｈ逡逑后收集细胞上清，采用ＥＬＩＳＡ法检测细胞上清中ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－ｌｐ和ＩＬ－６的表达逡逑７ｊＣ平。如表２－１所示，与对照组相比，经ＬＰＳ刺激后，上清液中ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－ｌｊ３逡逑和ＩＬ－６的表达水平均有所上调，，而同时过表达ＮＦＩＡ后，ＬＰＳ刺激所导致的促逡逑炎因子的上调作用有所减弱。因此
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.5

【参考文献】