间充质干细胞外泌体对心肌缺血再灌注后巨噬细胞极化的影响及作用机制研究

发布时间：2020-04-06 16:50

【摘要】：研究背景:急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是世界范围内死亡的主要原因。随着冠脉介入治疗的普及,绝大多数心梗患者可通过冠脉血运重建治疗挽救濒死的心肌,大大降低了临床病死率。然而,这种再灌注过程本身亦可诱导心肌细胞损伤,即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,myocardialI/R injury),常表现为心肌顿抑、心律失常和心肌能量代谢改变等等。心肌缺血再灌注损伤已成为患者从缺血后复流获益的主要障碍,如何预防和减少再灌注损伤是临床上亟待解决的问题。免疫激活在心肌缺血再灌注损伤的发生发展过程中发挥重要作用。当缺血的心肌恢复血流后,由于氧自由基的大量产生,受损的心肌细胞释放内源性的危险信号招募炎症细胞归巢,启动/放大局部炎症反应,造成心肌细胞继发性损伤。单核巨噬细胞在缺血再灌注诱发的炎症反应中扮演重要的作用。起初巨噬细胞以M1型为主,能释放多种促炎细胞因子和趋化因子,诱导炎症反应促进吞噬死亡细胞。而随着时间的推移,M1型细胞加重组织损伤、心肌凋亡的负面作用逐渐显现,巨噬细胞逐渐向M2型转化,M2型巨噬细胞能够大量合成与释放抗炎细胞因子、免疫抑制因子和多种生长因子,具有抑制炎症反应和促进心肌组织修复的功能。故如何在缺血再灌注后,促进巨噬细胞由M1向M2型转化,抑制过度激活的炎症反应受到越来越多的关注和研究。间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是具有自我更新及多向分化潜能的成体干细胞,被广泛应用于受损心肌再生及修复领域。早期的研究发现,MSC移植到缺血再灌注损伤后的心肌组织中,具有化成为心肌样细胞的潜力。然而随着研究的不断深入,人们发现MSC直接分化能力十分有限,其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用多是通过旁分泌途径来实现的。外泌体是一种能被大多数细胞分泌的微小囊泡,直径大约30-150nm,其内包含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸。目前认为,外泌体是MSC细胞发挥旁分泌作用的重要物质基础。故本研究拟探讨MSC来源的外泌体是否通过调节巨噬细胞极性的改变,对心肌缺血再灌注损伤起保护作用,并对可能的分子机制行初步探讨,为其应用于临床实验提供理论依据。研究方法:(1)利用超速离心法从MSC培养上清液中提取外泌体,并利用纳米颗粒跟踪分析技术、透射电镜及免疫印迹分析对提取出的外泌体进行鉴定。(2)构建小鼠心肌缺血再灌注模型,再灌注后即刻心肌内注射MSC外泌体,观察MSC外泌体是否对心肌缺血再灌注损伤及其诱导的心肌炎症反应具有治疗作用。(3)通过给小鼠尾静脉注射氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞,观察巨噬细胞清除后MSC外泌体对心肌的保护作用是否被削弱。(4)运用流式细胞术、免疫印迹分析等方法在体内及体外实验中观察MSC外泌体对巨噬细胞表型的影响。(5)通过对MSC外泌体进行miRNA测序并结合既往文献,筛选出其中可能参与巨噬细胞极化调节的miRNA,并通过miRNA功能学实验进行验证。(6)结合miRNA靶基因的生物信息学预测结果,通过免疫印迹分析等实验对其下游通路进行探讨。结果:(1)利用超速离心法可成功提取出直径在30-150nm,具有脂质双分子层结构,表达特殊表面标记的外泌体。(2)再灌注后即刻心肌内注射MSC外泌体能够改善小鼠心功能,减少心梗面积,抑制心室重构,减轻心肌组织内的炎症反应。(3)巨噬细胞被清除后,MSC外泌体对心肌缺血再灌注损伤的治疗作用被削弱,提示巨噬细胞可能是其发挥心肌保护作用的靶点。(4)在体内及体外实验中均观察到MSC外泌体可以促进巨噬细胞由M1型向M2型转化。(5)MSC外泌体中富含miR-182,通过miRNA功能学实验证实miR-182能够促进巨噬细胞向M2型转化。当抑制MSC外泌体中miR-182的功能后,可以观察到MSC外泌体促进巨噬细胞极化作用被削弱。(6)MSC外泌体通过转运miR-182抑制TLR4/NF-κB信号通路,同时激活PI3K/Akt信号通路实现促进巨噬细胞极化的作用。结论:MSC外泌体通过转运miR-182作用于巨噬细胞,调节TLR4/NF-KB/PI3K/Akt信号通路,促进心肌缺血再灌注后巨噬细胞向M2型转化,抑制心肌炎症反应,从而减轻心肌缺血再灌注损伤。
【图文】：

心肌缺血再灌注后的炎症反应X23]

图１．２心肌缺血再灌注后巨噬细胞的表型转化过程［３１】逡逑既往研究表明，心梗后给予巨噬细胞集落刺激因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ邋ｃｏｌｏｎｙ逡逑ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ邋ｆａｃｔｏｒ，Ｍ－ＣＳＦ）能够增强心肌内巨噻细胞的浸润，，从而改善心功能，逡逑
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R542.22

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本文编号：2616769