壳寡糖调节巨噬细胞自噬抑制泡沫化作用机制研究

发布时间：2020-04-07 04:41

【摘要】：目的:动脉粥样硬化(AS)是一种进行性多病灶的脉管系统炎症性疾病,与高血脂、高血压、糖尿病以及肥胖等疾病具有密切联系,对全身各个重要组织器官均有影响。随着动脉粥样硬化不断发展,血管内壁脂质堆积、炎性反应和血管壁异常重建逐渐增多,使血管内膜增生形成斑块;在动脉粥样硬化后期这些斑块非常不稳定,容易破裂并脱落形成动脉血栓,这是导致急性心血管事件的主要原因。动脉粥样硬化斑块形成是一个复杂的过程,其影响因素众多,脂质和胆固醇代谢异常对于促进动脉粥样硬化斑块形成发挥了重要作用。巨噬细胞吞噬大量脂质形成的泡沫细胞是动脉粥样硬化斑块中的主要成分,同时也是导致斑块不稳定的关键因素。增强巨噬细胞自噬,促进RAW264.7巨噬细胞中胆固醇外排、抑制ox-LDL摄取对于抑制泡沫细胞形成,减缓动脉粥样硬化斑块形成和减少粥样硬化斑块的不稳定性具有十分重要的意义。壳寡糖是一类天然碱性多糖,目前已经发现具有多种生物活性,包括抗炎、抗肿瘤、抗病毒以及抗阿尔兹海默病等。主要为了考察壳寡糖对巨噬细胞泡沫化和自噬的调控作用及其可能的作用机制。方法:采用的是氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的巨噬细胞源泡沫细胞模型,通过油红O染色、总胆固醇含量测定评价壳寡糖对巨噬细胞内脂质堆积的影响;采用荧光标记氧化型低密度脂蛋白(Dil-LDL)和25-NBD胆固醇检测巨噬细胞ox-LDL摄取和胆固醇外流水平;使用Western blot技术来检测胆固醇流入和流出相关蛋白(ABCA1、ABCG1、SR-A、CD36)以及自噬相关蛋白(LC3II/I、P62)的表达水平,观察壳寡糖对RAW264.7巨噬细胞自噬和泡沫化的影响;最后对自噬上游关键分子mTOR进行特异性干扰,通过Western blot技术检测p-mTOR、mTOR、LC3、p62等蛋白表达并且进行定量分析,探讨壳寡糖调控巨噬细胞自噬可能的机制;最后通过油O染色技术和总胆固醇检测试剂盒观察自噬抑制剂3-MA对RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响,进一步研究壳寡糖调控巨噬细胞自噬与壳寡糖调控巨噬细胞内脂质堆积和泡沫化的作用之间的关系。结果:200μg/ml的壳寡糖可以显著抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的RAW264.7巨噬细胞内脂质堆积,降低细胞内胆固醇水平;壳寡糖显著调节RAW264.7巨噬细胞中与胆固醇外排和吸收关键蛋白表达,抑制RAW264.7巨噬细胞脂质堆积和泡沫化。200μg/ml壳寡糖处理RAW264.7巨噬细胞12h后明显上调细胞中LC3II/LC3I水平同时显著下调P62水平,壳寡糖明显提高RAW264.7巨噬细胞中自噬活性。在探究壳寡糖促进RAW264.7巨噬细胞自噬可能的分子机制时采用相应的化合物干扰细胞自噬以及mTOR的表达,实验的结果表明,选择氯喹可以显著降低壳寡糖促进RAW64.7巨噬细胞自噬的作用,这是由于氯喹作为自噬抑制剂可以特异性抑制细胞内晚期自噬;亮氨酸作为自噬抑制剂可以促进mTOR的表达,在使用壳寡糖处理RAW264.7巨噬细胞的同时使用亮氨酸后检测到mTOR磷酸化水平升高,并且壳寡糖上调RAW264.7巨噬细胞自噬标志蛋白的作用被抑制;表明壳寡糖可能通过抑制mTOR磷酸化上调RAW264.7巨噬细胞自噬水平。使用自噬抑制剂处理RAW264.7巨噬细胞可抑制了壳寡糖降低RAW264.7巨噬细胞内脂质堆积的作用。综上所述壳寡糖可能通过调控mTOR蛋白表达促进RA264.7巨噬细胞自噬从而进一步抑制巨噬细胞泡沫化。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5

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本文编号：2617461