OPN靶向诊疗一体化纳米探针用于双模态成像引导的动脉易损斑块光动力治疗
发布时间：2020-04-18 11:13
【摘要】：研究背景与目的:动脉粥样硬化易损斑块(vulnerable atherosclerotic plaques,VASPs)的破裂以及继发血栓形成是引起急性心血管事件和猝死的主要因素,因此在疾病早期能够同时实现VASPs的精确诊断和靶向治疗具有重要的临床意义。纳米药物递送系统依托分子影像技术可靶向动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块实现多模态成像,并且能够提高抗动脉粥样硬化药物的治疗效果。骨桥蛋白(osteopontin,OPN)被认为是动脉粥样硬化炎症反应的重要参与者,并在AS斑块部位高表达,尤其是与巨噬细胞来源的泡沫细胞和合成型平滑肌细胞相关的部位。因此可作为识别VASPs的分子标志物。光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)可在光敏剂到达病变组织后,在特定波长激光照射下产生大量单线态氧,选择性杀伤靶细胞。基于上述背景,本课题构建了具有良好生物兼容性的基于人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的纳米药物,通过耦联OPN活性短肽和二氢卟吩e6(chlorin e6,Ce6)(螯合Mn2+行磁共振成像),同时包载光敏剂吲哚菁绿(indocyanine green,ICG),实现以无创方式通过荧光/磁共振双模态精准识别易损斑块的同时,利用ICG对VASPs部位进行PDT,靶向杀伤VASPs内泡沫巨噬细胞和合成型平滑肌细胞,从而抑制斑块进展,提高其稳定性。研究方法:1.将RAW264.7细胞和MOVAS细胞与低密底脂蛋白共孵育24h构建模型,分别通过免疫荧光和Western Blot验证模型组与对照组OPN在细胞水平的表达差异;对ApoE-/-小鼠单侧颈动脉放置缩窄环后高脂喂养20-24周建立颈动脉易损斑块模型,通过血管大体油红染色,颈动脉斑块HE、马松、天狼星红染色及OPN、CD68、α-SMA的免疫组化来验证模型的建立及OPN的表达。2.将HSA分别连接OPN活性短肽和Ce6,并通过静电作用力在PBS溶液中共包载ICG形成ICG-HSA-Ce6-OPN peptide纳米药物。用透射电镜、马尔文纳米粒径分析仪、紫外和荧光分光光度计对纳米药物进行表征,验证其是否成功制备及具备PDT下生成活性氧的能力。3.在细胞水平将纳米药物分别与泡沫巨噬细胞和合成型平滑肌细胞模型共孵育,验证靶向性纳米药物是否能被模型细胞大量摄取;在动物水平,通过尾静脉将纳米药物注射到小鼠体内,用荧光和磁共振双模态成像来验证靶向性纳米药物能否准确识别VASPs。4.在细胞水平通过CCK-8实验验证纳米药物的毒性以及PDT对靶细胞的杀伤作用;流式细胞术检测PDT是否诱导细胞凋亡;在动物水平对小鼠连续三周PDT后行磁共振成像检测其治疗效果。研究结果:1.细胞免疫荧光和Western Blot结果均证实泡沫巨噬细胞及合成型平滑肌细胞较活化前OPN的表达量明显增加,且活化后巨噬细胞内OPN表达量更显著。小鼠颈动脉易损斑块免疫组化结果也证实OPN与CD68和α-SMA的表达能够共定位,且在VASPs内可见显著表达。证实OPN可作为分子标志物来监测VASPs。2.电镜结果表明制备的纳米药物粒径均一,大小约20nm,容易渗透进动脉斑块内部被细胞摄取;马尔文纳米粒径分析仪检测到纳米药物体系较稳定,不易发生团聚现象;紫外吸收光谱可见各组分的特征吸收峰,证实纳米药物制备成功;荧光光谱证实纳米药物在波长808nm激光照射下可迅速产生单线态氧,并逐渐趋于稳定。3.泡沫巨噬细胞和合成型平滑肌细胞对OPN靶向的纳米药物均具有良好的摄取能力,证实了 OPN靶向的纳米药物对模型细胞的良好识别能力。动物在体荧光成像观测到靶向性纳米探针能够富集于易损斑块模型区域,且在进入体内30min时信号最强,而在对照组观测不到明显的荧光信号。在体磁共振成像也观测到同样的结果,说明靶向性纳米药物可精准识别易损斑块。4.CCK-8实验证实纳米药物对细胞的毒性很小,生物相容性良好,但在PDT下对细胞的杀伤能力显著增强;流式细胞术表明PDT是通过诱导细胞凋亡来发挥治疗效应;动物在体磁共振成像也证实PDT治疗后,小鼠颈动脉管腔狭窄程度得到缓解,斑块稳定性也有所提高。研究结论:OPN可以作为动脉易损斑块平滑肌细胞增殖和巨噬细胞活化的分子标志物,靶向OPN的纳米药物通过荧光/磁共振双模态成像,在细胞和动物水平均能精准识别动脉易损斑块,且纳米药物可通过光动力治疗诱导斑块内细胞凋亡,缩小斑块面积,提高斑块稳定性。
【图文】：
离子水冲洗切片。逡逑８）苏木素染液染核５ｍｉｎ后，用１％盐酸－乙醇溶液分化数秒，，去离子水冲洗；逡逑９）切片脱水及透明化处理方法同前。逡逑１０）晾干后用中性树胶封片，置于显微镜下观察。逡逑２．７统计学分析逡逑用Ｅｘｃｅｌ邋２０１６绘制ＢＳＡ标准曲线。用Ｉｍａｇｅ邋Ｊ软件对细胞免疫焚光和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ蛋白条带进行半定量分析。用ＧｒａｐｈＰａｄ邋Ｐｒｉｓｍ邋７软件进行数据处理和分析。数据先行正态性检验，符合正态性的连续型变量以均数±标准差表示，分类变量以频数或分数表示。组间比较采用独立样本ｔ检验，若数据不符合正态性分布，则采用相应的逡逑非参数检验方法。对于分类变量，采用秩和检验。Ｐ＜0．0５认为差异具有统计学意义。逡逑３邋结果逡逑３．１泡l赴冢希校蔚谋泶镥义希铃危希校五危模粒校慑危停澹颍纾邋危洛义
本文编号：2632038
【图文】：
离子水冲洗切片。逡逑８）苏木素染液染核５ｍｉｎ后，用１％盐酸－乙醇溶液分化数秒，，去离子水冲洗；逡逑９）切片脱水及透明化处理方法同前。逡逑１０）晾干后用中性树胶封片，置于显微镜下观察。逡逑２．７统计学分析逡逑用Ｅｘｃｅｌ邋２０１６绘制ＢＳＡ标准曲线。用Ｉｍａｇｅ邋Ｊ软件对细胞免疫焚光和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ蛋白条带进行半定量分析。用ＧｒａｐｈＰａｄ邋Ｐｒｉｓｍ邋７软件进行数据处理和分析。数据先行正态性检验，符合正态性的连续型变量以均数±标准差表示，分类变量以频数或分数表示。组间比较采用独立样本ｔ检验，若数据不符合正态性分布，则采用相应的逡逑非参数检验方法。对于分类变量，采用秩和检验。Ｐ＜0．0５认为差异具有统计学意义。逡逑３邋结果逡逑３．１泡l赴冢希校蔚谋泶镥义希铃危希校五危模粒校慑危停澹颍纾邋危洛义
本文编号：2632038
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