Rab18对PLIN2介导巨噬细胞内脂质蓄积的影响及作用机制

发布时间：2020-04-23 10:41

【摘要】：脂滴相关蛋白PLIN2通过促进细胞内脂质蓄积及抑制胆固醇流出而促进泡沫细胞的形成,同时还与动脉粥样硬化斑块的不稳定性密切相关,因此在动脉粥样硬化的发生发展中发挥着重要的作用。有研究表明小分子GTP结合蛋白Rab18与PLIN2共定位于脂滴上,过表达Rab18能使脂滴上PLIN2的数目减少。同时,Rab18过表达还可引起脂滴-内质网的接触。用RNA干扰或brefeldin A处理降低PLIN2表达后,可引起同样的形态学改变。这提示Rab18与PLIN2之间存在着某种联系,Rab18可能是PLIN2的一个上游调节基因。本课题组前期研究发现蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)可与Ox-LDL协同上调PLIN2表达并使细胞内脂滴的蓄积极大地增强。此外,有研究发现一些PKC亚型的功能与Rab蛋白密切相关。依据这些研究,我们提出“Rab18通过调控PKCα表达,影响PLIN2介导的巨噬细胞内脂质蓄积”的理论假设。在本研究中,我们分别使用动物学及细胞学研究方法,观察动脉粥样硬化的ApoE-/-(载脂蛋白E敲除)小鼠主动脉组织中Rab18、PKCα和PLIN2蛋白表达情况,过表达活化型或失活型Rab18对荷脂THP-1巨噬细胞中PKCα、PLIN2表达及脂质蓄积的影响,以及激活或抑制PKCα对过表达Rab18的荷脂THP-1巨噬细胞中PKCα、PLIN2表达及脂质蓄积的影响,探讨Rab18对PLIN2介导的巨噬细胞内脂质蓄积的影响及作用机制。在动物实验中,使用8周龄的ApoE-/-小鼠24只,随机分为对照组、实验组(对照组8只,实验组16只),饲喂12周,其中对照组予以普通饲料,实验组予以高胆固醇饲料,处死小鼠前从实验组中随机分出8只予以禁食48h处理。体视显微镜下观察小鼠主动脉粥样硬化病变情况,主动脉切片HE染色、油红O染色、Masson染色观察小鼠主动脉窦病变情况,Western blot检测小鼠主动脉组织Rab18、PKCα和PLIN2蛋白表达。在细胞实验中,(1)Ox-LDL(50 mg/L)处理THP-1巨噬细胞不同时间段(0,6,12,24 h);(2)将野生型Rab18(WT)、显性突变型Rab18(Q67L)和显性负性突变型Rab18(S22N)的慢病毒表达质粒通过脂质法转染THP-1巨噬细胞,Ox-LDL(50 mg/L)处理24 h;(3)将显性突变型Rab18(Q67L)慢病毒表达质粒转染THP-1巨噬细胞,Ox-LDL(50 mg/L)处理24 h,然后分别用PKC激动剂PMA(100 nmol/L)和抑制剂Calphostin C(300 nmol/L)处理16 h。采用Western blot检测细胞内Rab18、PKCα和PLIN2蛋白表达情况,油红O染色观察细胞内脂质积蓄情况。研究发现,(1)动脉粥样硬化的小鼠主动脉组织内Rab18、PKCα和PLIN2蛋白表达水平较对照组明显升高,其中禁食48 h小鼠Rab18水平进一步上调,PKCα和PLIN2表达水平较实验组中未禁食小鼠下降。(2)随着Ox-LDL处理时间的增加,THP-1巨噬细胞细胞内Rab18、PKCα和PLIN2的蛋白表达增加,其中PKCα和PLIN2表达增加较Rab18出现早,同时在此过程中胞浆内荷脂情况越来越明显。(3)Rab18(WT)及Rab18(Q67L)转染组THP-1细胞内PKCα和PLIN2表达明显降低,细胞内脂质蓄积减少,而Rab18(S22N)转染组PKCα和PLIN2表达及细胞内脂质蓄积较对照组无明显差异。(4)100 nmol/L PMA抵消过表达Rab18(Q67L)对PKCα、PLIN2的抑制作用,细胞内脂质蓄积有所增加;300 nmol/L Calphostin C则协同增强过表达Rab18(Q67L)对荷脂THP-1巨噬细胞内PKCα、PLIN2表达的抑制作用,同时进一步减少细胞内脂质积蓄。研究结果,Rab18通过PKCα下调PLIN2表达,从而减少巨噬细胞内脂质蓄积。
【图文】：

斑块形成,情况,内胶,原纤维

2 章动脉粥样硬化的 ApoE-/-小鼠主动脉组织内 Rab18、PKCα 和 PLIN2 蛋白表达升性密切相关，因此我们采用 Masson 染色观察 Apo-/-小鼠主动脉窦纤维，结果显示，HF 组和 HF-fasting 组斑块内胶原纤维含量较 C。

斑块形成,情况,蛋白表达,动脉粥样硬化

图 1.2 小鼠主动脉窦斑块形成情况（×40）注： *P < 0.05，vs. control（n=6）动脉粥样硬化小鼠主动脉组织内 Rab18、PKCα 和 PLIN显上调estern blot 检测各组小鼠主动脉组织内 Rab18、PKCα 和 PLIN2 蛋结果显示（图 1.3），与 Control 组相比，HF 组和 HF-fasting 组小鼠 Rab18、PKCα 和 PLIN2 蛋白表达均明显上调，其中 HF-fasting 平较 HF 组进一步上调，，而 PKCα、PLIN2 蛋白表达则较 HF 组下
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54

【参考文献】