白介素-12p35对血管紧张素Ⅱ诱导小鼠高血压心肌肥厚炎症和自噬的影响

发布时间：2020-04-25 06:34

【摘要】：研究目的:该实验使用C57BL/6J背景的野生型(wild-type,WT)小鼠和白介素-12p35基因敲除(interleukin-12p35 knockout,IL-12p35-KO)小鼠复制血管紧张素II(angiotensin II,Angll)所致的高血压心肌肥厚模型,研究心肌肥厚发生和发展过程中IL-12p35的表达情况,探讨IL-12p35基因缺失对心肌肥厚过程中的炎症和自噬调节作用,为临床治疗高血压所致心肌肥厚提供新的治疗靶点和实验依据。实验方法:1.实验分组:10-12周雄性野生型C57BL/6J 16只,随机分成2组,每组8只,A组:阴性对照组,B组:阳性对照组;10-12周IL-12p35-KO雄性小鼠(C57BL/6J背景)16只,随机分成2组,每组8只,C组:实验组D组:条件对照组。2.血压监测:使用小动物血压测量仪(BP-98A,Softron,Japan)进行尾动脉测量血压和心率。3.心脏超声:使用小动物超声仪(Visual Sonics Vevo2100)进行数据采集。4.心肌肥厚的检测:Real-time PCR检测心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)、I型胶原蛋白(Collagen I)的表达。5.心肌体重指数:心肌质量/体重(Heart weight/Body weight,HW/BW)观察心肌肥厚情况。6.心肌纤维化:使用Masson三色特殊染色法检测心肌组织纤维化程度。7.心肌炎症浸润:使用苏木精和伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色观察炎症的浸润情况,免疫组织化学染色法检测CD3、CD68的表达。8.自噬的检测:使用蛋白免疫印记(Western Blot,WB)和免疫组化化学染色检测微管相关蛋白-1轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、p62的表达。9.心肌肥厚IL-12p35的表达:Real-time PCR检测IL-12p35。10.信号通路:使用WB检测JAK2/STAT4(signal transducers and activators of transcription)通道磷酸化情况,进行下游通路机制的研究。11.统计:使用SPSS18.0软件进行数据的统计分析,所有数据都以均数±标准差表示,2组间的比较采用t检验,多组之间比较采用one-way ANOVA,P0.05认为差异有统计学意义,P0.01为有显著统计学差异,P0.001为有极其显著的统计学差异。实验结果:在AngⅡ灌注前4组的基础血压没有统计学差异,AngⅡ灌注后3天血压开始升高,在第3周达到峰值,持续至第4周,并且心脏超声和心肌肥厚标志物:ANP、BNP、Collagen I mRNA的检测表明高血压心肌肥厚建模成功,其中IL-12p35-KO+AngⅡ组收缩压(systolic blood pressure,SBP)、HW/BW较WT+AngⅡ组明显升高,并且有统计学意义。HE、Masson染色反映了AngⅡ微量渗透泵持续灌注的小鼠,心肌纤维化、炎症细胞浸润明显、心肌细胞肥大、排列紊乱,肌纤维断裂,细胞核畸形、空泡样变较显著,其中IL-12p35-KO+AngⅡ组较WT+AngⅡ组明显,并且有统计学意义。持续的AngⅡ微量渗透泵灌注增加了CD3、CD68的表达。IL-12p35基因的缺失使自噬反应增强,并且促进了JAK2/STAT4信号通路的磷酸化,而AngⅡ微量渗透泵灌注加重了自噬反应和JAK2/STAT4信号通路的磷酸化。经过AngⅡ微量渗透泵灌注后的小鼠,WT+AngⅡ组小鼠心肌组织中IL-12p35mRNA表达较WT组明显升高。实验结论:通过AngⅡ微量渗透泵灌注建立了高血压心肌肥厚小鼠模型,研究表明IL-12p35基因的缺失可以促使血压更高,增大HW/BW,加重炎症浸润、心肌细胞肥大、排列紊乱、肌纤维断裂、细胞核畸形、空泡样变和自噬水平,同时也可以激活JAK2/STAT4信号通路的磷酸化,并且WT+AngⅡ组小鼠心肌组织中IL-12p35mRNA表达较WT组明显升高。说明IL-12p35基因不仅参与了AngⅡ诱导的高血压心肌肥厚的病理过程,而且还具有抑制炎症和调控自噬的效应,并且这些生物学效应可能是由JAK2/STAT4信号通路介导的。由此可见IL-12p35可能成为防治高血压所致心肌肥厚的新靶点。
【图文】：

微量渗透泵植入皮下之前对各组小鼠基础血压水平的测量数据显示各组间无统计学差异。在 AngII 灌注后第 3 天小鼠 SBP 就有了明显的升高，并且维持高血压状态到实验结束。其中 WT 组 vs.p35-KO 组 P>0.05 无统计学差异；WT 组 vs.WT+AngII 组，p35-KO 组 vs.p35-KO+AngII 组有极其显著的统计学差异，*P<0.001;WT+AngII 组 vs.p35-KO+AngII 组在微量渗透泵灌注 1 周内血压与基础值相比都有明显升高，但是血压升高幅度没有明显差异，1 周后测量收缩压数据显示 p35-KO+AngII 组较 WT+AngII 组血压仍在继续升高并且在第 3 周达到最高值，两组间数据出现明显差异，#P<0.01(图 3-1-1)。实验结束时称量小鼠体重(BW)、取出小鼠心脏后重量(HW)计算 HW/BW,结果显示 HW/BW：WT 组(5.08±0.189mg/g)vs.WT+AngII 组(6.07±0.46mg/g)，，p35-KO 组(5.16 ±1.44mg/g)vs.p35-KO+AngII 组(7.10±0.328mg/g)，WT+AngII组vs.p35-KO+AngII组有极其显著的统计学差异*P<0.001(图 3-1-2)。其中不同组间小鼠心脏实物图从左至右分别是 p35-KO+AngII 组、WT+AngII 组、WT 组见(图 3-1-3),有实物图可见 AngII 微量渗透泵灌注后 4 周是心脏增大，其中 p35-KO+AngII 组增大较 WT+AngII 组明显。图 3-1-1 图 3-1-2

Fig.3-5 Autophagy图 3-5-1：p62 表达 WT+AngII 组 vs.WT 组*P<0.05；p35-KO 组 vs.WT 组#P<0.01；p35-KO+AngII 组 vs.WT 组**P<0.001；LC3 II/I 的比值：WT+AngII、p35-KO+AngII、p35-KO组 vs.WT 组*P<0.01。图 3-5-2：p62 的免疫组织化学染色，可以明显的看出 p35-KO+AngII 组p62 高表达，n=3。3.6 IL-12p35 基因的缺失增加了 JAK2/STAT4 的磷酸化我们通过免疫印记实验检测小鼠心脏内 JAK2/STAT4 通路的磷酸化，结果显示IL-12p35 基因的缺失显著增加了 JAK2/STAT4 的磷酸化，p35-KO+AngII、p35-KO组与 WT 组相比 JAK2 通道的磷酸化增加，*P<0.01；p35-KO+AngII、p35-KO 组与 WT 组相比 STAT4 的磷酸化显著增加，*P<0.01,P35-KO+AngII 与 WT+AngII 组相比 STAT4 的磷酸化增加并且有统计学意义，#P<0.05(图 6)。
【学位授予单位】：河北工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.2;R544.1

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